地奧司明激活JAK2-STAT3信號通路減輕小鼠腦缺血再灌注損傷的實驗研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:缺血性腦血管病因高發(fā)病率、高致殘率和高病死率嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康。缺血后繼發(fā)性損傷是缺血性腦血管病病情加重的主要原因,其機制主要包括細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、線粒體功能異常等,其中細(xì)胞凋亡是患者病情進展加重及影響預(yù)后的重要因素,尋求有效的手段抑制凋亡,改善神經(jīng)功能缺損,是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究的重點。盡管細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)機制并不十分清晰,但最近的實驗研究和臨床觀察顯示:抗凋亡蛋白Bcl-2與凋亡前蛋白Bax的平衡在調(diào)節(jié)凋亡中具有關(guān)鍵

2、作用。大量研究表明Janus activated kinase-2(JAK2)/signaltransducer and activator of transcription-3(STAT3)信號通路的激活能夠降低Bax/Bcl-2的比值,減少腦梗死后凋亡細(xì)胞數(shù)量,減小腦梗死體積,發(fā)揮腦保護作用。近年來,關(guān)于致病機制的研究取得了很大進展,但有效治療藥物仍不足。地奧司明(Diosmin)是一種微?;兓狞S酮類化合物,研究發(fā)現(xiàn)地奧司明在慢

3、性靜脈功能不全、肝缺血再灌注損傷、糖尿病、癌癥等疾病中具有抗凋亡、抗炎等作用,而地奧司明在腦缺血中的作用及機制罕見報道。本實驗在小鼠短暫性大腦中動脈阻塞(transientmiddle cerebral artery occlusion,tMCAO)所致腦缺血再灌注模型上,觀察局部腦缺血損傷后大腦皮層JAK2,phosphorylated JAK2(pJAK2),STAT3及phosphorylated STAT3(pSTAT3)的動態(tài)

4、表達(dá),并研究地奧司明在腦缺血/再灌注急性期的保護作用及其對JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3、Bcl-2及Bax的影響。
  方法:采用成年健康雄性CD-1小鼠,應(yīng)用改良Longa線栓法建立小鼠右側(cè)tMCAO模型。實驗一:動態(tài)觀察腦缺血再灌注后不同時間點JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3的表達(dá),實驗分為正常對照組、缺血再灌注后3h、6h、12 h、24 h、48 h、72 h六個時間點組。實驗二:測定腦缺血

5、再灌注后地奧司明的神經(jīng)保護作用,實驗動物隨機分為假手術(shù)組(Sham)、tMCAO組、Vehicle組(tMCAO+10%乳糖)、地奧司明小劑量組(Vehicle+Diosmin50 mg/kg,DM-L)、地奧司明大劑量組(Vehicle+Diosmin100 mg/kg,DM-H)。溶劑對照組和藥物干預(yù)組動物分別預(yù)給藥(灌胃)6天,每天一次,于末次給藥后1小時行短暫性右側(cè)大腦中動脈栓塞術(shù)。tMCAO組和Sham組同樣方法灌胃但給予等容

6、量生理鹽水。術(shù)后24 h對小鼠進行神經(jīng)功能評分,評分完畢后將動物斷頭處死,用干濕重法測定腦組織含水量,用2%的2,3,5-三苯基四唑氮紅(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法測定腦梗死體積,用尼氏染色法觀察腦組織中的尼氏小體,用免疫組化、western blotting和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3、Bcl-2和Bax的表達(dá),采用激光共聚焦技

7、術(shù)觀察pSTAT3的表達(dá)部位。
  結(jié)果:
  1.JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3的動態(tài)觀察:JAK2、STAT3在各組間的表達(dá)無明顯差異,pJAK2、pSTAT3的表達(dá)在腦缺血/再灌注3h后開始升高,并于24 h達(dá)高峰,72 h后開始降低。
  2.地奧司明對JAK2、pJAK2、STAT3、pSTAT3、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響:JAK2、STAT3在各組間表達(dá)無明顯變化。pJAK2、pSTAT

8、3在tMCAO組和Vehicle組表達(dá)較Sham組增加,地奧司明干預(yù)后表達(dá)量進一步增多,地奧司明大劑量組pJAK2、pSTAT3蛋白表達(dá)及陽性細(xì)胞數(shù)增多,與Vehicle組相比結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);腦梗死后Bcl-2蛋白和基因表達(dá)及陽性細(xì)胞數(shù)明顯降低,而Bax表達(dá)則明顯增加,地奧司明大劑量組Bcl-2蛋白和基因表達(dá)及陽性細(xì)胞數(shù)較Vehicle組增多,結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),Bax表達(dá)則較Vehicle組減少(P<0

9、.05);地奧司明小劑量組可上調(diào)pJAK2、pSTAT3及Bcl-2的表達(dá),下調(diào)Bax表達(dá),但趨勢不穩(wěn)定。
  3.激光共聚焦:pSTAT3在Sham組少見表達(dá),而且主要表達(dá)在神經(jīng)元胞漿,Vehicle組和DM-H組可見pSTAT3表達(dá)增多,以后者明顯,而且主要在細(xì)胞核表達(dá)。
  4.神經(jīng)功能評分:Sham組無明顯神經(jīng)功能缺損,而tMCAO組、Vehicle組、地奧司明小劑量組和地奧司明大劑量組小鼠均出現(xiàn)不同程度的左側(cè)肢體偏

10、癱。Vehicle組與tMCAO組神經(jīng)功能評分無明顯差異,地奧司明大劑量組的神經(jīng)功能評分明顯低于Vehicle組(P<0.05),地奧...司明小劑量組與Vehicle組相比,神經(jīng)功能評分雖有所改善,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
  5.腦組織含水量測定:腦缺血/再灌注后Vehicle組和tMCAO組腦組織含水量均明顯高于Sham組(Sham vs.Vehicle and tMCAO:78.24%±1.71% vs.84.01%±1.12

11、% and84.16%±0.75%,P<0.01),地奧司明大劑量組病變側(cè)腦組織含水量明顯低于Vehicle組(DM-H vs.Vehicle:81.78%±1.12% vs.84.01%±1.12%,P<0.01),地奧司明小劑量組病變側(cè)腦組織含水量低于Vehicle組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
  6.腦梗死體積(%HLV)的測定:Sham組無梗死灶。Vehicle組和tMCAO組可見明顯梗死灶,而且兩組間腦梗死體積無明顯差異。與

12、Vehicle組相比,地奧司明干預(yù)組梗死體積均明顯減小,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Vehicle vs.DM-L and DM-H:62.06%±4.86% vs.40.42%±6.60% and21.44%±3.77%,P<0.01)。
  7.尼氏染色:與Sham組相比,tMCAO組和Vehicle組尼氏小體數(shù)量明顯下降。地奧司明干預(yù)能明顯增加尼氏小體陽性細(xì)胞數(shù),與Vehicle組相比結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),DM-H組變化更

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