氨基糖甙類藥物對無義突變的HERG通道的藥物拯救研究.pdf

1、目的：檢測無義突變HERG通道的表達水平；探討氨基糖甙類抗生素G—418和慶大霉素在異源表達系統(tǒng)中對導致LQT2的無義突變的純合的HERG通道的作用，分析同一種氨基糖甙類藥物對不同突變體作用差異性的原因；闡明HERG基因無義突變致LQT2的發(fā)病機制；探討不同氨基糖甙類藥物對雜合的HERG通道的干預效應，評價不同氨基糖甙類藥物對某一種HERG通道的作用差異性；檢測氨基糖甙類藥物對存在轉(zhuǎn)運缺陷的錯義突變體是否具有拯救效應。 方法：①

2、采用聚合酶鏈反應法制備四種HERG C末端無義突變體—R1014X、W927X、R863X和E698X，并克隆到真核細胞表達載體中。將野生型(WT) HERG和四種無義突變體的質(zhì)粒擴增、純化，然后瞬時轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的HEK293細胞，同時共轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)基因作為目的基因轉(zhuǎn)染成功的標志物。配制記錄HERG通道電流所需的電極內(nèi)液、外液，設置HERG通道穩(wěn)態(tài)激活的電流—電壓關(guān)系曲線(Ⅰ—Ⅴ曲線)的刺激參數(shù)。在轉(zhuǎn)染了目的質(zhì)粒36～48h

3、后的HEK293細胞上，應用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄通道電流。藥物拯救采用將轉(zhuǎn)染24h后的HEK293細胞在含G—418或慶大霉素(終濃度為400μg/ml)的培養(yǎng)基中孵育24h。在膜片鉗記錄前，換用不含藥物的培養(yǎng)基洗脫1h。②采用western blot的方法檢測野生型和突變的HERG通道蛋白的表達情況，觀察突變體是否產(chǎn)生截短的通道蛋白、是否存在轉(zhuǎn)運缺陷等。應用HERG通道N端抗體檢測藥物干預前通道蛋白的表達，應用HERG通道C端抗體檢測

4、藥物干預后通道蛋白的表達。③制作HEK293細胞爬片，應用共聚焦顯微鏡定性檢測野生型和突變的HERG通道蛋白在細胞膜和細胞漿內(nèi)的分布情況，觀察突變體是否會產(chǎn)生免疫熒光、熒光主要分布在胞膜還是胞漿等。應用HERG通道N端抗體檢測藥物干預前突變通道蛋白的細胞內(nèi)分布，應用HERG通道C端抗體檢測藥物干預后突變通道蛋白的細胞內(nèi)分布。 結(jié)果：⑴HEK293細胞表達模型的建立：HEK293細胞經(jīng)連續(xù)傳代培養(yǎng)后，貼壁生長良好，呈多邊形類上皮細

5、胞樣。在細胞轉(zhuǎn)染前一天，將培養(yǎng)瓶中的細胞用胰酶消化，接種約1×105細胞于35mm培養(yǎng)皿。當細胞貼壁生長融合50％～70％時，進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后36～48小時在熒光顯微鏡下觀察，瞬時轉(zhuǎn)染效率約為50％～60％，轉(zhuǎn)染陽性的HEK293細胞帶綠色熒光，未轉(zhuǎn)染的細胞不帶綠色熒光。挑選帶綠色熒光、邊緣清楚、表面光滑、大小適中的細胞進行全細胞膜片鉗記錄。⑵無義突變HERG通道的電流表達：野生型HERG通道表現(xiàn)出典型的電壓依賴性激活和內(nèi)向整流特性，其

6、最大尾電流密度為47.8±6.3 pA/pF(n=12)。R1014X和W927X突變體均能表達典型的HERG樣電流，但與野生型HERG通道相比，最大尾電流密度明顯下降(R1014X：3.9±1.4 pA/pF，n=8，P<0.01；W927X：11.6±2.4 pA/pF，n=8，P<0.01)。R863X和E698X突變體僅表達與未轉(zhuǎn)染的HEK293細胞上類似的內(nèi)生性電流，在至少8個細胞上均未記錄到尾電流，說明二者并不能形成功能性的

7、HERG通道。⑶氨基糖甙類藥物對純合突變的HERG通道的干預效應：氨基糖甙類藥物能增強R1014X和W927X的電流表達，使其尾電流幅值明顯增加。經(jīng)過400μg/mlG—418和慶大霉素干預后，R1014X突變體的最大尾電流密度分別增加至12.7±3.3 pA/pF(n=7，P<0.05)和18.3±3.7 pA/pF(n=8，P<0.05)。與野生型HERG通道相比，R1014X的激活曲線左移，通道的半激活電壓更負；藥物干預后，其激活

8、動力學特性亦得到恢復。慶大霉素干預對W927X亦有效，其最大尾電流密度增至19.5±2.7 pA/pF(n=7，P<0.05)。通道激活動力學特征在野生型HERG、W927X和W927X加慶大霉素干預組均沒有明顯差異。然而，慶大霉素干預對R863X和E698X突變體并無明顯作用，仍然未能記錄到尾電流，僅表達內(nèi)生性電流。⑷無義突變通道蛋白的表達及其在細胞內(nèi)的分布形式：野生型HERG通道表達兩個蛋白條帶約在135KDa和155KDa處，分別

9、代表經(jīng)過核心糖基化后的未成熟蛋白和經(jīng)過復合糖基化后的成熟蛋白形式。R1014X突變體經(jīng)抗HERG通道N端抗體檢測，顯示兩個蛋白條帶約在120KDa和140KDa處，說明無義突變產(chǎn)生了截短的通道蛋白。R863X突變體則僅顯示一個蛋白條帶約在90KDa處，說明R863X不僅產(chǎn)生了截短的通道蛋白，同時還存在轉(zhuǎn)運缺陷。⑸氨基糖甙類藥物對無義突變HERG通道蛋白的影響：應用HERG通道C端抗體檢測藥物干預的效果。野生型HERG通道仍表達135KD

10、a和155KDa兩個蛋白條帶，而R1014X并未顯示任何條帶。經(jīng)G—418和慶大霉素干預后，出現(xiàn)與野生型通道蛋白位置一致的兩個蛋白條帶，說明氨基糖甙類藥物誘導了全長的有功能的通道蛋白的表達。而慶大霉素對存在轉(zhuǎn)運障礙的錯義突變體N470D并無明顯作用，說明氨基糖甙類藥物并不能糾正轉(zhuǎn)運缺陷。⑹氨基糖甙類藥物對負顯性抑制的干預效應：鑒于LQT2呈常染色體顯性遺傳，患者的基因型往往為正常和突變等位基因共存的雜合子，因此進一步對雜合通道(WT/R

11、1014X)進行檢測。WT/R1014X通道的最大尾電流密度為13.1±2.2pA/pF(n=8)，低于野生型HERG通道的50％，說明R1014X對野生型HERG通道存在負顯性抑制效應。為了驗證氨基糖甙類藥物是否能消除此負顯性效應，以400μg/ml G—418和慶大霉素干預WT/R1014X通道。G—418和慶大霉素對雜合的WT/R1014X通道作用效應不同：慶大霉素能使WT/R1014X的最大尾電流密度增加2.2倍(29.2±3.

12、7 pA/pF，n=12，P<(0.05)，G—418卻無明顯效應(13.7±1.8pA/pF，n=8，P>0.05)。WT/R1014X通道的激活動力學特征與野生型HERG相比無明顯差異，藥物干預對其亦無明顯影響。 結(jié)論：①HERG通道C末端無義突變體是否能表達功能性的通道電流，取決于其從C末端截短的氨基酸殘基的多少。②氨基糖甙類藥物能增強純合的HERG通道無義突變的功能性表達，恢復其通道的電生理特性。③氨基糖甙類藥物能抑制提