從調(diào)控線粒體自噬探討小續(xù)命湯有效成分組對(duì)缺血性腦卒中的作用機(jī)制.pdf

1、腦卒中又稱腦中風(fēng)或腦血管意外，是由于腦部供血障礙或腦血管破裂引起的一種急性腦血管疾病，分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中兩種，死亡率和致殘率極高，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。然而，由于缺血性腦卒中病理進(jìn)程復(fù)雜，迄今為止正式被批準(zhǔn)使用的有效治療藥物還為數(shù)不多。中藥復(fù)方小續(xù)命湯是治療缺血性腦卒中的經(jīng)典方劑，小續(xù)命湯有效成分組是依據(jù)小續(xù)命湯適應(yīng)癥腦缺血的發(fā)病機(jī)制，通過(guò)體外篩選模型優(yōu)化確定的小續(xù)命湯抗腦缺血的有效藥理活性組分。前期研究證實(shí)小續(xù)命湯有效

2、成分組能夠作用于缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體，顯著改善缺血后神經(jīng)元線粒體能量代謝障礙，提高線粒體膜電位，抑制線粒體凋亡途徑。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注損傷與線粒體自噬功能紊亂有著密切的聯(lián)系，缺血性損傷導(dǎo)致線粒體功能受損，而線粒體自噬清除受損線粒體，完成損傷線粒體的降解，維持自身穩(wěn)態(tài)平衡，實(shí)現(xiàn)線粒體質(zhì)量控制，因此靶向調(diào)節(jié)線粒體自噬或能降低腦缺血再灌注損傷。
　　基于此，本課題以線粒體自噬為切入點(diǎn)，提出線粒體網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)態(tài)失衡在缺血性腦卒中發(fā)

3、生發(fā)展過(guò)程中具有重要意義，小續(xù)命湯有效成分組可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體自噬，調(diào)控線粒體穩(wěn)態(tài)失衡改善神經(jīng)元功能來(lái)治療缺血性腦卒中。因此，本研究采用局灶性腦缺血再灌注大鼠為觀察對(duì)象，以小續(xù)命湯有效成分組為干預(yù)手段，探討小續(xù)命湯有效成分組對(duì)模型大鼠腦缺血改善情況，觀察其對(duì)線粒體功能及線粒體自噬變化的影響，從調(diào)節(jié)線粒體自噬的角度揭示小續(xù)命湯有效成分組對(duì)缺血性腦卒中的作用機(jī)制。
　　第一部分 小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦線粒體功能損傷

4、的影響
　　目的：考察小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦線粒體功能損傷的影響。
　　方法：選用健康雄性SD大鼠，體重250g-280g，隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、模型(Model)組、小續(xù)命湯有效成分組(XXMD)低、中、高劑量組和金納多(EGb761)組，插線法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO)模型，缺血2h后實(shí)現(xiàn)再灌注，假手術(shù)組大鼠不進(jìn)行線栓插入操作。待大鼠清醒后給予藥物，小續(xù)命湯有效成分組和金納

5、多均采用灌胃給藥，每日一次，連續(xù)四天。測(cè)定給藥4天時(shí)MCAO大鼠缺血周邊區(qū)大腦皮層組織線粒體膜腫脹度、ATP酶活性(Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase)以及線粒體超氧陰離子(O2-)和鈣離子含量，研究小續(xù)命湯有效成分組對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦線粒體功能的影響。
　　結(jié)果：與模型組相比，給藥4天時(shí)小續(xù)命湯有效成分組能夠顯著改善MCAO大鼠的腦線粒體功能損傷，表現(xiàn)為顯著改善腦缺血再灌注大鼠腦線粒體Na+-K+-A

6、TPase(P＜0.05，P＜0.01)和Ca2+-Mg2+-ATPase活力(P＜0.05，P＜0.01)，降低線粒體鈣離子含量(P＜0.01）和超氧陰離子含量(P＜0.05）。
　　結(jié)論：小續(xù)命湯有效成分組能夠減輕腦缺血再灌注導(dǎo)致的線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)和鈣超載，改善線粒體功能。
　　第二部分 小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦線粒體自噬的影響及作用機(jī)制研究
　　目的：考察小續(xù)命湯有效成分組對(duì)局灶性腦缺血再灌

7、注大鼠皮層神經(jīng)元不同時(shí)間點(diǎn)線粒體自噬的影響及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：選用健康雄性SD大鼠，體重250g-280g，隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、模型(Model)組、小續(xù)命湯有效成分組（XXMD）中劑量組和自噬激活劑雷帕霉素(RAP)組，插線法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO)模型，缺血2h后實(shí)現(xiàn)再灌注，假手術(shù)組大鼠不進(jìn)行線栓插入操作。待大鼠清醒后給予藥物，小續(xù)命湯有效成分組采用灌胃給藥，雷帕霉素采用腹腔注射給藥，每日一次

8、，連續(xù)四天。采用Zea-Longa's級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法和神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)評(píng)小續(xù)命湯有效成分組和雷帕霉素給藥對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠行為學(xué)的影響，TTC染色法檢測(cè)大鼠腦梗死體積百分比和半球腫脹。Western blot法檢測(cè)給藥后24h、48h、72h和96h時(shí)自噬及線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3、P62、Beclin-1及BNIP3的表達(dá)水平變化，透射電鏡觀察再灌注24h時(shí)缺血半暗帶皮層神經(jīng)元細(xì)胞中線粒體形態(tài)及線粒體自噬超微結(jié)

9、構(gòu)。
　　結(jié)果：與模型組相比，給藥4天時(shí)小續(xù)命湯有效成分組和雷帕霉素能夠顯著改善MCAO大鼠神經(jīng)功能缺損，表現(xiàn)為降低MCAO大鼠mNSS評(píng)分(P＜0.05，P＜0.01)，延長(zhǎng)MCAO大鼠在平衡木上的停留時(shí)間(P＜0.05，P＜0.01)。TTC結(jié)果顯示，小續(xù)命湯有效成分組和雷帕霉素能夠顯著減少給藥4天時(shí)MCAO大鼠腦組織梗死體積百分比(P＜0.05，P＜0.01)，并可顯著縮小其半球腫脹(P＜0.01）。Western blot

10、檢測(cè)結(jié)果顯示，腦缺血再灌注24h時(shí)，缺血周邊區(qū)腦組織中自噬及線粒體自噬均被顯著激活，表現(xiàn)為細(xì)胞總蛋白和純化線粒體蛋白中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化顯著增多(P＜0.05，P＜0.01)，細(xì)胞總蛋白中P62、Beclin-1及BNIP3的表達(dá)水平發(fā)生下降（P＜0.05），而純化線粒體蛋白中P62及BNIP3的表達(dá)水平則顯著上升(P＜0.05，P＜0.01)。缺血再灌注48h時(shí)線粒體自噬被抑制，且隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，線粒體自噬出現(xiàn)持續(xù)下降

11、現(xiàn)象。與模型組相比，小續(xù)命湯有效成分組給藥24h時(shí)，能夠通過(guò)降低P62、Beclin-1、BNIP3的表達(dá)水平以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值(P＜0.05，P＜0.01)抑制腦缺血再灌注后24h時(shí)線粒體自噬的過(guò)度激活。其對(duì)線粒體自噬的抑制作用延續(xù)至再灌注48h，隨著時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，小續(xù)命湯有效成分組對(duì)線粒體自噬的抑制作用消失。缺血再灌注時(shí)間延長(zhǎng)至96h時(shí)，小續(xù)命湯有效成分組對(duì)P62、Beclin-1及BNIP3的表達(dá)出現(xiàn)明顯激活作用(

12、P＜0.05，P＜0.01），并能增加LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(P＜0.05)，從而激活線粒體自噬，促進(jìn)受損線粒體的自噬性清除。電鏡檢測(cè)結(jié)果顯示，腦缺血再灌注24h時(shí)，模型組大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞中有大量空泡結(jié)構(gòu)的自噬泡及大量線粒體自噬結(jié)構(gòu)。與模型組相比，XXMD給藥組大鼠腦神經(jīng)元核膜較為完整，細(xì)胞器較模型組明顯增多，自噬泡及線粒體自噬結(jié)構(gòu)明顯減少。
　　結(jié)論：腦缺血再灌注后線粒體自噬隨病程進(jìn)展呈現(xiàn)先激活后抑制現(xiàn)象，過(guò)高和過(guò)低的線

13、粒體自噬均不利于神經(jīng)細(xì)胞的存活。小續(xù)命湯有效成分組能夠調(diào)節(jié)缺血后不同時(shí)間點(diǎn)自噬及線粒體自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，抑制缺血再灌注后24h時(shí)線粒體自噬的過(guò)度激活，促進(jìn)缺血再灌注后期線粒體自噬。
　　第三部分 應(yīng)用線粒體自噬抑制劑后觀察小續(xù)命湯有效成分組對(duì)腦缺血再灌注損傷的影響
　　目的：考察應(yīng)用線粒體自噬抑制劑mdivi-1后對(duì)小續(xù)命湯有效成分組腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用的影響及機(jī)制。
　　方法：選用健康雄性SD大鼠，體重25

14、0g-280g，隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、模型(Model)組、小續(xù)命湯有效成分組(XXMD)中劑量組、小續(xù)命湯有效成分組聯(lián)合線粒體自噬抑制劑mdivi-1作用(XXMD+MDI)組及線粒體自噬抑制劑mdivi-1組，插線法制備大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO)模型，缺血2h后實(shí)現(xiàn)再灌注，假手術(shù)組大鼠不進(jìn)行線栓插入操作。待大鼠清醒后給予藥物，小續(xù)命湯有效成分組采用灌胃給藥，mdivi-1采用腹腔注射給藥，每日一次，連續(xù)四天。采

15、用Zea-Longa's級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分法和神經(jīng)功能缺損評(píng)分(mNSS)實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察小續(xù)命湯有效成分組以及小續(xù)命湯有效成分組聯(lián)合mdivi-1給藥對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠行為學(xué)的影響，TTC染色法檢測(cè)大鼠腦梗死體積百分比和半球腫脹，Western blot法檢測(cè)給藥4天時(shí)，MCAO大鼠腦線粒體中自噬及線粒體自噬相關(guān)蛋白LC3、P62、Beclin-1及BNIP3的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：與XXMD組相比，應(yīng)用線粒體自噬抑制劑mdivi-1后

16、，小續(xù)命湯有效成分組對(duì)腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用顯著減弱，表現(xiàn)為MCAO大鼠mNSS評(píng)分升高(P＜0.05），在平衡木上的停留時(shí)間減少(P＜0.05），腦組織梗死體積百分比增多(P＜0.01），并可增加其半球腫脹(P＜0.05）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，應(yīng)用線粒體自噬抑制劑mdivi-1后，小續(xù)命湯有效成分組大鼠腦線粒體P62和Beclin-1的表達(dá)降低(P＜0.05，P＜0.01)，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化減少(