基因組代謝網(wǎng)絡(luò)模型方法模擬重組大腸桿菌生產(chǎn)羥基-L-脯氨酸和葫蘆巴堿的研究.pdf

1、目的：
　　將基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型與代謝工程（重組大腸桿菌生產(chǎn)羥基-L-脯氨酸和葫蘆巴堿）結(jié)合，對(duì)大腸桿菌模型進(jìn)行相關(guān)途徑修改后，對(duì)比不同分析方法的模擬效果，以及預(yù)測(cè)可行的基因敲除策略，并優(yōu)化M9培養(yǎng)基培養(yǎng)大腸桿菌的條件和嘗試重組葫蘆巴堿合成酶的表達(dá)生產(chǎn)。
　　方法：
　　1.下載大腸桿菌BL21(DE3)的代謝網(wǎng)絡(luò)模型:iB21_1397，并添加合成羥基-L-脯氨酸和葫蘆巴堿的合成途徑，形成兩個(gè)新的模型。
　

2、　2.對(duì)未修改的iB21_1397模型進(jìn)行基本的FBA(flux balance analysis)分析，以及必需基因預(yù)測(cè)，指導(dǎo)M9培養(yǎng)基的優(yōu)化。
　　3.將添加代謝途徑后的產(chǎn)羥基-L-脯氨酸和葫蘆巴堿模型，進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)表型的模擬，并且結(jié)合使用FVA、OptKnock、GDLS、IdealKnock等不同方法進(jìn)行基因敲除策略的預(yù)測(cè)，比較各模擬結(jié)果的差異。
　　4.根據(jù)模擬結(jié)果設(shè)計(jì)五組改良后的M9培養(yǎng)基:葡萄糖組、甘油組、葡萄

3、糖鐵組、葡萄糖甘油組和倍量葡萄糖組。制備懸菌液后各接種0.1 mL至新鮮的各種改良M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)。研究菌落數(shù)生長(zhǎng)差異時(shí)，在培養(yǎng)12 h后，接種至LB瓊脂培養(yǎng)基中，18h后計(jì)數(shù)。研究對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌落數(shù)差異時(shí)，則分別在培養(yǎng)12h、18h、24 h后，接種至各種相應(yīng)的M9瓊脂培養(yǎng)基中，72 h后計(jì)數(shù)。
　　5.通過(guò)基因庫(kù)里的葫蘆巴堿合成酶CTgS2(BAC43759.1)的信息，合成基因片段，利用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、XhoⅠ在pET2

4、4a(+)的酶切位點(diǎn)，將基因片段與載體pET24a(+)連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)，對(duì)轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌在相同的培養(yǎng)條件下，以終濃度為0.3 mM、0.6 mM、1mM的IPTG以及終濃度為0.8 g/L的TNDA-1蛋白促進(jìn)劑為誘導(dǎo)劑，分別誘導(dǎo)6h、8h、10h。誘導(dǎo)結(jié)束后將細(xì)菌體破碎并進(jìn)行SDS-PA

5、GE電泳，觀察重組蛋白的表達(dá)情況。
　　成果：
　　1.成功實(shí)踐了代謝網(wǎng)絡(luò)模型的改造和修改，F(xiàn)BA各分析方法基本都能執(zhí)行成功，并與文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)。
　　2.用代謝網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)了促進(jìn)羥基-L-脯氨酸產(chǎn)量的基因敲除策略:可通過(guò)敲除酮戊二酸脫氫酶、果糖6-磷酸醛縮酶、異檸檬酸裂合酶、磷酸甘油酸酯脫氫酶實(shí)現(xiàn)合成酶的過(guò)表達(dá)，該策略結(jié)合比對(duì)其他分析結(jié)果后發(fā)現(xiàn)其具有一定可信度。
　　3.用代謝網(wǎng)絡(luò)模型預(yù)測(cè)了促進(jìn)葫蘆巴堿產(chǎn)

6、量的基因敲除策略:可通過(guò)敲除乙醛脫氫酶、蘋果酸酶、丙酮酸激酶、轉(zhuǎn)氫酶實(shí)現(xiàn)合成酶的過(guò)表達(dá)。
　　4.M9培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方面，就碳源的選擇而言，葡萄糖的增菌效果是較甘油明顯的。培養(yǎng)基中添加Fe2+或增加同類碳源濃度，都能促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，且增菌效果沒(méi)有明顯的差異，只有在培養(yǎng)24 h后出現(xiàn)差異，基本符合模擬結(jié)果。
　　5.重組葫蘆巴堿合成酶研究方面，重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切和測(cè)序驗(yàn)證后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3)，進(jìn)行不同濃度誘導(dǎo)劑和不同

7、誘導(dǎo)時(shí)間的蛋白誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE電泳，發(fā)現(xiàn)各條件下都沒(méi)有順利誘導(dǎo)出目標(biāo)蛋白。但是通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，對(duì)重組蛋白技術(shù)有了一定的認(rèn)識(shí)，并在連接載體的選擇、基因重組驗(yàn)證等技術(shù)方面積累了相關(guān)的經(jīng)驗(yàn)。
　　結(jié)論：
　　1.代謝工程可以便利地結(jié)合基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行模擬和分析，而FBA分析則在預(yù)測(cè)最大產(chǎn)量和預(yù)估可提升空間的方面有很大的指導(dǎo)作用。
　　2.用IdealKnock方法篩選的備選敲除反應(yīng)比用FVA方法篩選的要更有效，

8、更適合用于OptKnock進(jìn)行基因敲除預(yù)測(cè)。
　　3.OptKnock方法雖然在預(yù)測(cè)基因敲除方面耗時(shí)較長(zhǎng)，但是只要結(jié)合適合的模型反應(yīng)預(yù)處理方法，計(jì)算成功率比GDLS方法高。
　　4.經(jīng)過(guò)模擬預(yù)測(cè)，對(duì)于重組大腸桿菌生產(chǎn)羥基-L-脯氨酸的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，敲除酮戊二酸脫氫酶(AKGDH)、果糖6-磷酸醛縮酶(F6PA)、異檸檬酸裂合酶(ICL)、磷酸甘油酸酯脫氫酶(PGCD)，可以有利于脯氨酸4-羥化酶的過(guò)表達(dá)。
　　5.對(duì)于

9、重組大腸桿菌生產(chǎn)葫蘆巴堿的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，敲除乙醛脫氫酶(ALDD2y)、蘋果酸酶(ME2)、丙酮酸激酶(PYK)、NAD(P)轉(zhuǎn)氫酶(THD2pp)，可以有利于葫蘆巴堿合成酶的過(guò)表達(dá)。
　　6.代謝網(wǎng)絡(luò)FBA分析的模擬結(jié)果，對(duì)M9培養(yǎng)基的優(yōu)化具有很強(qiáng)指導(dǎo)意義，對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)，加入適當(dāng)量的Fe2+，可以有效地促進(jìn)生長(zhǎng)，無(wú)需靠提高葡萄糖的濃度，碳源方面，葡萄糖在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)方面比甘油稍優(yōu)，但是如果生產(chǎn)中需要使用甘油，需要適當(dāng)?shù)靥岣吒视蜐?/p>