自噬對同種移植排斥的影響及調(diào)節(jié)機理.pdf

1、研究背景及目的意義：
　　器官移植可以挽救重要器官衰竭患者的生命，而目前移植術(shù)后發(fā)生的免疫排斥仍然是影響移植器官存活的最主要因素。利用多種策略誘導(dǎo)移植物產(chǎn)生免疫耐受，避免排斥，是移植免疫領(lǐng)域研究的最重要目標(biāo)。研究結(jié)果表明，T淋巴細胞作為移植排斥反應(yīng)的主要效應(yīng)細胞，是影響移植物存活的關(guān)鍵細胞。因此針對T細胞介導(dǎo)的同種排斥機制的研究，有望在誘導(dǎo)長期移植耐受方面取得重要進展。
　　自噬是一種存在于真核細胞的，應(yīng)對壓力的自穩(wěn)調(diào)節(jié)機制

2、。同種移植排斥反應(yīng)是一種強烈的刺激信號，機體的自噬機制必然對這一過程產(chǎn)生多層次多方面精細調(diào)節(jié)，從而使移植受體保持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定平衡。新近研究報道，自噬可從多個方面參與T細胞功能調(diào)節(jié)，影響T細胞的激活和存活，影響細胞因子的分泌。自噬可通過調(diào)控Treg細胞數(shù)量及活性影響移植排斥。
　　雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）是一種目前臨床常用的免疫抑制劑，可抑制T細胞增殖，調(diào)節(jié)多種細胞因子的分泌水平，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生移植免疫耐

3、受。在多種不同疾病模型中，雷帕霉素可刺激產(chǎn)生不同種類的細胞因子，發(fā)揮多種多樣的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。雷帕霉素還可誘導(dǎo)自噬激活。細胞因子是調(diào)節(jié)細胞活化，分化及效應(yīng)的重要分子，可影響移植耐受的誘導(dǎo)。在自噬激活的狀態(tài)下，同種移植排斥是否發(fā)生了變化，細胞因子分泌譜是否改變，最終是否影響同種移植物的存活，這些問題目前尚不清楚。3MA已作為自噬抑制劑用于多種模型的研究。在雷帕霉素作用下，使用3MA抑制自噬，能否影響雷帕霉素的免疫抑制效果，其分子機理如何，這

4、些問題都有待進一步闡明。
　　近期研究表明，Toll樣受體5(TLR5)的激活劑鞭毛蛋白能延長同種異體移植物的生存，增加Treg細胞的數(shù)量。雷帕霉素誘導(dǎo)的同種移植耐受模型中，TLR5高表達。由于雷帕霉素在誘導(dǎo)耐受同時也增加了移植物自噬，自噬是否影響TLR5靶向同種移植排斥顯像，對于TLR5靶向顯像監(jiān)測移植排斥具有重要意義。
　　本論文通過兩個部分，研究了雷帕霉素作用下同種移植物的生存狀況以及自噬對同種移植耐受的影響和機理。一

5、是研究自噬激活劑雷帕霉素及自噬抑制劑3MA對同種移植物的生存狀況及機體免疫效應(yīng)細胞的影響，對移植受體自噬分子表達的影響及調(diào)節(jié)。二是利用小鼠皮膚同種移植模型，研究自噬抑制劑體內(nèi)處理后，移植排斥部位TLR5靶向的放射性核素顯像是否受到影響。
　　第一部分自噬調(diào)節(jié)對同種移植耐受的影響及分子機理
　　研究方法：
　　1.同種皮膚移植模型建立:按照常規(guī)方法建立同種移植急性排斥小鼠模型，并隨機分為四組:對照組、雷帕霉素組、3MA組

6、和聯(lián)合組;不同組分別進行雷帕霉素和/或3MA處理。
　　2.雷帕霉素作用下同種移植皮片細胞因子測定:分離移植后第4天和第12天模型小鼠的移植皮片，RT-PCR檢測細胞因子水平。
　　3.自噬分子表達分析:分離移植后第4、12天的對照組和雷帕霉素組受體鼠脾CD4+和CD8+T細胞，進行Western Blot分析，檢測自噬分子表達。分離移植后第12天對照組和雷帕霉素組受體鼠CD4+T細胞，用3MA體外處理8h，WesternB

7、lot檢測自噬分子表達。分離第12天模型小鼠脾CD4+及CD8+T細胞，然后進行RT-PCR，檢測細胞自噬分子表達。
　　4.排斥期細胞因子檢測:RT-PCR檢測移植后第12天的四組模型小鼠脾CD4+T細胞的細胞因子。收集不同處理組模型小鼠血清，ELISA測定IL-10和IFN-γ的水平。
　　5.Treg細胞分析:移植后第12天四組模型小鼠的脾CD4+T細胞被分離后，進行RT-PCR分析，檢測Foxp3和TGF-β表達水平

8、。提取移植后第12天模型小鼠脾細胞，流式細胞術(shù)分析Treg比例。
　　6.細胞增殖分析:分離野生型BALB/c小鼠脾細胞，與C57B/6小鼠進行混合淋巴細胞培養(yǎng)，分別檢測雷帕霉素和/或3MA處理之后效應(yīng)淋巴細胞增殖狀況。
　　7.移植物生存期研究:移植后第7天開始逐日觀察并記錄模型小鼠同種移植皮片生存狀況。
　　研究結(jié)果：
　　1.移植物細胞因子表達狀況:移植后第4天皮膚同種移植物Th1型(IL-2，IFN-γ)

9、、Th2型(IL-4，IL-10)、Th17型(IL-17a)細胞因子表達水平均低于移植后第12天。移植后第12天，雷帕霉素組的同種皮膚移植物顯示低Th1型(IL-2，IFN-γ)、高Th2型(IL-4，IL-10)和Th17型(IL-17a)細胞因子表達及高TGF-β表達。
　　2.自噬在同種移植耐受中表達及特點:移植后第4天及第12天4組模型小鼠中，各組自噬分子Beclin1與LC3Ⅱ/Ⅰ表達趨勢一致。在CD4+T細胞中，移植

10、后第4天及第12天的雷帕霉素組這兩種分子表達均明顯高于對照組，而CD8+T細胞中，僅移植后第12天時的雷帕霉素組中，這兩種分子表達高于對照組。在體外實驗中，雷帕霉素處理組的CD4+T細胞的自噬較未處理的對照組顯著增高，但增加3MA處理后，可使雷帕霉素組升高的自噬降低。體內(nèi)實驗中，雷帕霉素組CD4+T細胞ATG5表達比未處理對照組增高，但聯(lián)合組的CD4+T細胞ATG5表達比雷帕霉素單獨使用時低。體內(nèi)實驗中，CD8+T細胞ATG5的表達及雷

11、帕霉素和3MA的影響與CD4+T細胞類似。
　　3.CD4+T細胞及血清細胞因子的表達:移植后12天，與未處理的對照組相比，雷帕霉素組受體脾CD4+T細胞IL-4、IL-10（Th2型細胞因子）升高，IFN-γ(Th1型細胞因子)降低。雷帕霉素組小鼠血清中，IL-10升高，IFN-γ降低。與單獨雷帕霉素組相比，雷帕霉素與3MA聯(lián)合組受體脾CD4+T細胞的IL-4、IL-10以及血清IL-10明顯降低。
　　4.調(diào)節(jié)性T細胞及

12、相關(guān)因子表達:移植后12天，與未處理的對照組相比，CD4+T細胞中，雷帕霉素組Foxp3和TGF-β均升高。受體脾細胞中，雷帕霉素組CD25+Foxp3+Treg細胞均高于對照組。3MA使用后，F(xiàn)oxp3的表達和Treg的比例低于雷帕霉素組。
　　5.細胞增殖結(jié)果:MLR結(jié)果顯示，3MA和雷帕霉素單獨或聯(lián)合使用可以抑制效應(yīng)細胞的增殖。聯(lián)合組的細胞增殖較雷帕霉素單獨使用時升高。
　　6.移植物生存狀況:與對照組相比，雷帕霉素體

13、內(nèi)注射可顯著延長同種移植皮片的生存，而3MA單獨使用未明顯延長同種移植物的生存。聯(lián)合組與雷帕霉素的生存期無明顯差異，但是同種移植皮片狀態(tài)良好。
　　第二部分自噬調(diào)節(jié)對125I-anti-TLR5同種移植排斥靶向顯像的影響
　　研究方法：
　　1.放射性核素探針制備及鑒定:Iodogen法制備125I-anti-TLR5。進行標(biāo)記率、放化純和體外穩(wěn)定性分析。
　　2.體外特異性結(jié)合能力分析:分離BALB/c小鼠脾臟

14、，制備單個細胞懸液，進行雷帕霉素和3MA處理，然后分析125I-anti-TLR5與細胞的結(jié)合及解離趨勢。3.同種皮膚移植模型建立:建立小鼠同種皮膚移植模型，隨機分為對照組、雷帕霉素組、3MA組和聯(lián)合組四組，分別進行雷帕霉素和/或3MA處理。
　　4.體內(nèi)生物學(xué)分布研究:移植后第9天，對模型小鼠尾靜脈注射125I-anti-TLR5，72h后處死，進行生物學(xué)分布測定，計算靶非靶比值(T/NT ratio)。
　　5.動態(tài)全身

15、磷屏放射自顯影顯像:移植后第9天，模型小鼠注射125I-anti-TLR5，于注射后24h、48h、72h進行磷屏全身自顯影顯像，觀察移植皮片放射性濃聚狀況。
　　6.移植皮片病理學(xué)及免疫組化分析:分離移植后第12天的移植皮片，甲醛固定，石蠟包埋，制備切片，HE染色及Beclin1和TLR5免疫組化染色。
　　研究結(jié)果：
　　1.125 I-anti-TLR5的標(biāo)記率及穩(wěn)定性:成功制備125I-anti-TLR5，標(biāo)記

16、物的放化純?yōu)?5.88％，穩(wěn)定性好，72h穩(wěn)定性仍保持在90％以上。
　　2.標(biāo)記細胞結(jié)合及解離狀況:與對照組相比，125I-anti-TLR5的結(jié)合與解離在雷帕霉素組、3MA組及聯(lián)合組無明顯差異。
　　3.生物學(xué)分布研究:結(jié)果表明，各組模型小鼠的125I-anti-TLR5都是經(jīng)肝代謝和腎排泄，移植皮片處放射性計數(shù)最高。雷帕霉素組(13.25)的T/NT比值明顯高于對照組(4.32)及聯(lián)合組(6.46)。
　　4.動

17、態(tài)磷屏放射自顯影顯像:注射標(biāo)記物后48h，雷帕霉素及聯(lián)合組的移植皮片顯像清楚。48h和72h時，圖像放射性活度比值分析表明:雷帕霉素組(2.52，5.33)及聯(lián)合組(2.22，2.46)，比對照組(1.30，1.46)顯著升高。在72h時雷帕霉素組(5.33)比聯(lián)合組比值(2.46)明顯升高。
　　5.HE及免疫組化染色結(jié)果分析:移植皮片病理學(xué)HE染色表明，與雷帕霉素組和聯(lián)合組相比，對照組和3MA組炎性浸潤明顯;聯(lián)合組與雷帕霉素單

18、獨組相比，二者類似，均無明顯炎性浸潤。免疫組化染色結(jié)果表明，Beclin1與TLR5表達趨勢一致。與3MA組相比，對照組及雷帕霉素組Beclin1與TLR5表達增高，而聯(lián)合組無明顯變化。
　　全文總結(jié)：
　　1.同種皮膚移植急性排斥期Th1細胞因子的分泌顯著高于移植早期非特異性炎癥期。自噬激活劑雷帕霉素體內(nèi)應(yīng)用可誘導(dǎo)同種移植物低Th1型、高Th2和Th17型細胞因子表達。
　　2.自噬參與調(diào)節(jié)雷帕霉素誘導(dǎo)的耐受。抑制自

19、噬對雷帕霉素誘導(dǎo)耐受無明顯影響;自噬可促進雷帕霉素誘導(dǎo)的Th2型細胞因子優(yōu)勢、Treg細胞高比例和Foxp3高表達促進同種耐受。
　　3.雷帕霉素作用下，自噬抑制對TLR5靶向的放射性核素標(biāo)記分子探針監(jiān)測同種移植排斥無明顯影響。125I-anti-TLR5可用于免疫耐受狀態(tài)下同種移植排斥顯像。
　　本文研究結(jié)果為闡明自噬對同種移植排斥影響提供了理論基礎(chǔ)，為TLR5靶向特異性監(jiān)測同種移植物排斥提供了實驗依據(jù)，具有重要意義。

20、r>　　創(chuàng)新點：
　　1.自噬激活劑雷帕霉素體內(nèi)應(yīng)用可誘導(dǎo)同種移植物細胞因子譜改變，表達低Th1型、高Th2和Th17型細胞因子。
　　2.自噬參與調(diào)節(jié)雷帕霉素誘導(dǎo)的耐受，抑制自噬對雷帕霉素誘導(dǎo)的免疫耐受無明顯影響;自噬可促進雷帕霉素誘導(dǎo)的Th2型細胞因子優(yōu)勢、Treg細胞高比例和Foxp3高表達促進同種耐受。
　　3.自噬抑制對雷帕霉素作用下的TLR5靶向的放射性核素標(biāo)記分子探針對同種移植排斥監(jiān)測無明顯影響。125I