圭星擬威爾酵母WC91-2菌株嗜殺因子和β-1，3-葡聚糖酶的研究.pdf

1、分離純化了海洋嗜殺酵母Williopsis saturnus WC91-2菌株的β-1,3-葡聚糖酶,經(jīng)SDS-PAGE檢驗(yàn)是分子量為47.5kDa的單一蛋白。純化的β-1,3-葡聚糖酶水解海帶多糖的產(chǎn)物是單糖和二糖,具有外切β-1,3-葡聚糖酶活性,沒有嗜殺活性,其二級(jí)質(zhì)譜結(jié)果證實(shí)所純化蛋白為外切β-1,3-葡聚糖酶,含有序列YIEAQLDAFEKR。純化的β-1,3-葡聚糖酶,其最適作用溫度為40 ℃,50℃以下穩(wěn)定;最適作用pH值

2、為4.0,在pH 3-7.5之間較穩(wěn)定;BE2+、Ni2+和Li+對(duì)β-1,3-葡聚糖酶的活性具有顯著的激活作用,Zn2+、Mg2+、Ca2+、Na+、Fe3+、Fe2+、K+和Co2+對(duì)其酶活具有抑制作用,Hg2+、Cu2+、Mn2+和Ag+具有較強(qiáng)的抑制作用;蛋白抑制劑1,10-菲噦啉、EGTA、PMSF、EDTA、SDS和碘乙酸對(duì)其酶活均有抑制作用;純酶的米氏常數(shù)Km值為3.07 mg/ml,Vmax值為4.02 mg/(min*

3、ml)。
　　 分離純化了海洋酵母WC91-2菌株的嗜殺因子,它是分子量為11.0 kDa的單一蛋白,純化的嗜殺因子仍具有嗜殺活性,但不能水解海帶多糖,沒有β-1,3-葡聚糖酶活性。對(duì)于純化的WC91-2嗜殺因子,當(dāng)檢測培養(yǎng)基中的NaCl濃度為10.0％(w/v)時(shí)對(duì)敏感酵母菌株WCY的抑菌圈直徑最大;WC91-2嗜殺因子的最適作用溫度為16℃,在0-30℃范圍內(nèi)穩(wěn)定;最適作用pH值范圍是pH 3-3.5,在pn 3.0-5.0

4、范圍內(nèi)穩(wěn)定。
　　 克隆得到WC91-2嗜殺因子的基因,其ORF框全長為378個(gè)堿基,編碼125個(gè)氨基酸,基因序列與W.saturnus var.mrakii嗜殺因子的基因序列最為相似,信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果表明N-端19個(gè)氨基酸為信號(hào)肽,推導(dǎo)蛋白分子量為11.6 kDa,與分離純化的WC91-2嗜殺因子的分子量基本上相同。
　　 純化的WC91-2 β-1,3-葡聚糖酶對(duì)WC91-2嗜殺因子的嗜殺活性有抑制作用。通過純化的嗜殺

5、因子或者β-1,3-葡聚糖酶對(duì)海帶多糖和敏感酵母WCY細(xì)胞的結(jié)合實(shí)驗(yàn),推測β-1,3-葡聚糖酶與嗜殺因子競爭結(jié)合位于敏感菌株WCY細(xì)胞壁上的β-1,3-葡聚糖結(jié)合位點(diǎn),從而導(dǎo)致嗜殺因子與細(xì)胞的結(jié)合程度降低,對(duì)細(xì)胞的作用減弱,抑菌圈變小,表現(xiàn)出β-1,3-葡聚糖酶對(duì)嗜殺因子的嗜殺活性產(chǎn)生了抑制作用,嗜殺因子的嗜殺活性下降的現(xiàn)象。WC91-2菌株的嗜殺因子不是通過水解細(xì)胞壁上的葡聚糖來殺死細(xì)胞的,也不直接作用于敏感酵母細(xì)胞的細(xì)胞膜,不能殺死

6、敏感酵母’WCY細(xì)胞的原生質(zhì)體。推測WC91-2菌株嗜殺因子的初始結(jié)合位點(diǎn)很可能存在于敏感酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁上,并且很可能是細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖。通過實(shí)驗(yàn)和電鏡照片推測其殺菌機(jī)理為WC91-2菌株嗜殺因子的存在影響到了敏感酵母細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓,細(xì)胞內(nèi)壓導(dǎo)致孔道形成,胞內(nèi)物質(zhì)在不完整的細(xì)胞壁脆弱部位噴出而造成細(xì)胞死亡。
　　 利用簡并引物PCR、反向PCR及RT-PCR擴(kuò)增得到編碼WC91-2菌株β-1,3-葡聚糖酶基因的WsE

7、XG1基因及兩側(cè)部分基因共3153bp。基因WsEXG1的DNA序列為1254bp,沒有內(nèi)含子,在NCBI的登錄號(hào)為FJ875997.2?；騑sEXG1編碼417個(gè)氨基酸,經(jīng)預(yù)測前15個(gè)氨基酸為信號(hào)肽,有兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn),預(yù)測分子量為46.2 kDa,預(yù)測等電點(diǎn)為4.5。分析WsEXG1基因序列,推測出其啟動(dòng)子位于-28到-77的位置,含有一個(gè)TATA框,但是沒有CAAT框,其終止子在+1386到+1401的位置含有序列AAGAAC

8、AATAAACAA。推導(dǎo)蛋白與Pichia anomala和Candida albicans的β-1,3-葡聚糖酶分別有66.9％和59.4％的相似度。分析表明此蛋白含有糖基水解酶第5家族特征IGLELLNEPL,并含有一個(gè)序列為NLCGEWSAA的片段,其中的Glu-310(E)被認(rèn)為是催化親核體。
　　 利用pINA1317表達(dá)載體,將WC91-2菌株的WsEXG1基因在Yarrowia lipolytica Polh中成功

9、進(jìn)行了超表達(dá),得到了一株β-1,3-葡聚糖酶活力較高的菌株1317-G80。純化了重組β-1,3-葡聚糖酶,并對(duì)重組酶進(jìn)行了Western blotting鑒定。SDS-PAGE顯示純化的重組β-1,3-葡聚糖酶的分子量約為46 kDa。對(duì)于純化的重組β-1,3-葡聚糖酶,其最適作用溫度為40℃,40 ℃以下穩(wěn)定;最適作用pH為5.0,pH 5.0-9.5之間穩(wěn)定;B2+對(duì)其酶活有激活作用,Co2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Fe3