葉下珠復方Ⅱ號對肝癌細胞IGF-1R信號通路活化的抑制作用研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  探討葉下珠復方Ⅱ號通過抑制IGF-1R信號通路活化從而發(fā)揮抗肝癌作用的新機制,為其臨床應用提供新的實驗依據(jù)。
  方法:
  1.IGF-1R表達抑制肝癌Huh7細胞株建立
  采用siRNA基因沉默技術,依據(jù)siRNA靶序列設計原則,針對Huh7細胞IGF-1R序列,設計并合成三對核苷酸干擾序列,克隆入慢病毒pLVX-shRNA1載體,對shRNA表達的重組質粒提取、酶切鑒定,證實其序列與設計序列完

2、全一致。提取純化高質量的重組質粒,使用高效重組載體和病毒包裝質粒共轉染293T細胞,進行病毒包裝,收集病毒液,濃縮,純化病毒液。用病毒感染Huh7細胞,經(jīng)篩選后獲得穩(wěn)定感染的細胞株。通過Western blot法檢測anti-IGF-1R Huh7細胞(I1和I2)、Huh7-NC細胞和Huh7細胞中IGF-1R基因和蛋白表達的差異。
  2.葉下珠復方Ⅱ號對Huh7細胞和anti-IGF-1R Huh7細胞增殖的影響
  

3、采用MTT法檢測不同濃度葉下珠復方Ⅱ號作用48h對Huh7細胞、anti-IGF-1RHuh7細胞增殖的抑制作用效果,并計算出藥物半數(shù)抑制濃度;設置對照組、葉下珠復方Ⅱ號高劑量組(3.0mg/ml)、低劑量組(1.5mg/ml)、5-FU組(30μg/ml),每組4個復孔,檢測藥物作用于Huh7細胞及anti-IGF-1R Huh7細胞24h、48h的抑制作用效果。
  3.葉下珠復方Ⅱ號對Huh7細胞和anti-IGF-1R H

4、uh7細胞凋亡的影響
  設置細胞對照組、葉下珠復方Ⅱ號高劑量組(3.0mg/ml)、低劑量組(1.5mg/ml)、5-FU組(30μg/ml),每組3個復孔。葉下珠復方Ⅱ號作用于Huh7細胞及anti-IGF-1RHuh7細胞48h后,采用流式細胞儀AnnexinⅤ-FITC/PI法檢測細胞凋亡率。
  4.葉下珠復方Ⅱ號對Huh7細胞和anti-IGF-1R Huh7細胞基因表達的影響
  設置細胞對照組、葉下珠復

5、方Ⅱ號高劑量組(3.0mg/ml)、低劑量組(1.5mg/ml)、5-FU組(30μg/ml),每組3個復孔。葉下珠復方Ⅱ號作用于Huh7細胞及anti-IGF-1RHuh7細胞48h后,采用實時熒光定量PCR技術檢測葉下珠復方Ⅱ號對Huh7細胞及anti-IGF-1R Huh7細胞中IGF-1R信號通路基因表達的影響。
  結果:
  1.與Huh7細胞組比較,Huh7-NC、I1、I2細胞組中IGF-1R的表達明顯降低(

6、P<0.05),其中I1細胞組中IGF-1R的表達最低,故選取I1細胞作為穩(wěn)轉細胞株,即anti-IGF-1R Huh7細胞株構建成功。
  2.葉下珠復方Ⅱ號作用于Huh7細胞48h的半數(shù)抑制濃度為3.019mg/ml,作用于antj-IGF-1R Huh7細胞48h的半數(shù)抑制濃度為1.641mg/ml。
  葉下珠復方Ⅱ號對Huh7細胞和anti-IGF-1R Huh7細胞的增殖均有明顯的抑制作用(P<0.05),且隨劑

7、量增加,抑制效果越明顯。葉下珠復方Ⅱ號作用24h后,對anti-IGF-1R Huh7細胞的抑制作用比Huh7細胞更明顯(P<0.05);葉下珠復方Ⅱ號作用48h后,對anti-IGF-1R Huh7細胞的抑制作用比Huh7細胞更強,差異具有顯著性意義(P<0.05)。
  3.葉下珠復方Ⅱ號作用于Huh7細胞48h后,細胞早期凋亡率對比對照組顯著升高(P<0.05),說明葉下珠復方Ⅱ號對Huh7細胞有誘導其早期凋亡的作用。

8、>  4.葉下珠復方Ⅱ號作用于Huh7細胞和anti-IGF-1R Huh7細胞48h后,Huh7細胞中IGF-1R及PI3K、AKT3、N-RAS、K-RAS、C-RAF和ERK1基因的mRNA表達顯著降低(P<0.05);anti-IGF-1R Huh7細胞中IGF-1R及PI3K、AKT3、N-RAG、K-RAG、C-RAF和ERK1等基因的表達顯著降低(P<0.05)。與Huh7細胞相比,葉下珠復方Ⅱ治療后anti-IGF-1R

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