Klotho下調(diào)EgR-1抑制糖尿病腎臟病腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease，DKD)已成為終末期腎病(endstage renal disease，ESRD)的首要原因。既往認(rèn)為DKD早期主要病變部位在腎小球，而腎小管間質(zhì)纖維化是DKD發(fā)展到后期的病理學(xué)特征。然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)損害程度成為反映腎功能下降嚴(yán)重程度和判斷預(yù)后最重要的指標(biāo)，而腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-to-mesenchymal trans

2、ition，EMT)則是腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　Klotho是一種抗衰老因子，早期DKD患者血清Klotho水平已出現(xiàn)明顯的下降，是DKD較早出現(xiàn)的生物標(biāo)志物之一。Klotho可通過抑制TGF-β1/Smad3、ERK1/2信號(hào)通路，延緩DKD進(jìn)展。早期生長反應(yīng)蛋白-1(Early growth response protein1，Egr-1)，是一種具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，可通過與TGF-β1、ERK1/2形成正反饋環(huán)

3、路促進(jìn)腎臟纖維化。并且，已有研究表明，TGF-β1可通過激活ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)腎臟纖維化。
　　目前關(guān)于Klotho與Egr-1在DKD發(fā)病中是否有相互作用及作用機(jī)制的研究未見報(bào)道。本研究旨在探索Klotho和Egr-1在DKD腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)中發(fā)揮的作用，闡明在DKD進(jìn)展中Klotho是否通過抑制TGF-β1/Smad3-ERK1/2信

4、號(hào)下調(diào)Egr-1發(fā)揮抗腎臟纖維化作用，為深入理解DKD發(fā)病的分子機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　用HFD/STZ誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠(n=12)制造糖尿病模型，同系正常小鼠(n=12)作為對照。成模后分別于6w、12w時(shí)留取血、尿行生化指標(biāo)檢測，處死后取腎臟組織凍存于-80℃冰箱，或用4％多聚甲醛固定。PAS、Masson染色法觀察腎組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，免疫組化法分析腎皮質(zhì)中

5、Klotho和Egr-1表達(dá)的變化。
　　2、細(xì)胞培養(yǎng)
　　人腎小管上皮細(xì)胞株（HK2）購買于上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫，于含1.0g/L糖的DMEM培養(yǎng)基+10％FBS中培養(yǎng)，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中孵育。每2-3天傳代一次。
　　3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
　　轉(zhuǎn)染前一天，細(xì)胞接種于12孔板中，轉(zhuǎn)染時(shí)要求細(xì)胞密度達(dá)到60％或80％。使用lipo3000進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染siRNA或質(zhì)粒，siRNA轉(zhuǎn)染濃度為50nM，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度為

6、1ug/ml。
　　4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)
　　Trizol法提取組織及細(xì)胞總RNA。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。SYBR法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，β-actin為內(nèi)參，目的基因表達(dá)量按2-ΔΔCt方法計(jì)算得出。
　　5、Westem Blot
　　RIPA法提取組織及細(xì)胞總蛋白。配制10％的SDS-PAGE膠，每孔上樣量為20ug。電泳分離樣品蛋白，濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。

7、用5％脫脂奶粉或5％BSA封閉PVDF膜，一抗孵育PVDF膜，4℃搖床過夜。熒光二抗孵1h，TBST洗滌。在Odyssey近紅外成像系統(tǒng)發(fā)光顯影，Gel-Pro analyzer分析結(jié)果。
　　6、統(tǒng)計(jì)分析
　　各指標(biāo)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±SD）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，正態(tài)分布兩樣本比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05時(shí)被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、Klotho與Egr-

8、1在HFD/STZ誘導(dǎo)的DM小鼠腎皮質(zhì)中表達(dá)水平的變化研究
　　(1)與對照組相比，DM組小鼠血清Klotho水平6w時(shí)已明顯降低，12w進(jìn)一降低，24h尿微量白蛋白水平6w時(shí)已明顯升高，12w時(shí)進(jìn)一步升高。
　　(2)與對照組相比，DM組小鼠腎皮質(zhì)中Klotho表達(dá)水平6w時(shí)已明顯降低，12w時(shí)進(jìn)一步降低，Egr-1表達(dá)水平到12w時(shí)才出現(xiàn)明顯升高。
　　2、Klotho在DKD進(jìn)展中對腎小管EMT的作用研究

9、　　(1)HK2細(xì)胞中Klotho的表達(dá)水平在HG、TGF-β1刺激后12h出現(xiàn)明顯下降，24h進(jìn)一步降低。
　　(2)與pcDNA-Vector相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA-Klotho可抑制HG、TGF-β1誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)降低、α-SMA及FN表達(dá)升高。
　　(3)與si-Negative相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染si-Klotho可使HG、TGF-β1誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)進(jìn)一步降低、α

10、-SMA及FN表達(dá)進(jìn)一步升高。
　　3、Egr-1在DKD進(jìn)展中對腎小管EMT的作用研究
　　(1)HK2細(xì)胞中Egr-1的表達(dá)在HG、TGF-β1刺激后0.5h出現(xiàn)明顯的升高，6h回落到基線水平。
　　(2)與si-Negative相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染si-Egr-1可減弱HG、TGF-β1誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)降低、α-SMA及FN表達(dá)升高。
　　(3)與pENTER-Vector相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

11、pENTER-Egr-1可使HG、TGF-β1誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)進(jìn)一步降低、α-SMA及FN表達(dá)進(jìn)一步升高。
　　4Klotho在DKD進(jìn)展中下調(diào)Egr-1的機(jī)制研究
　　(1)與pcDNA-Vector相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA-Klotho可抑制HG、TGF-β1誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞中Egr-1表達(dá)升高、p-Smad3/Smad3及(p-ERK1/2)/(ERK1/2)蛋白比值升高。
　　(2)與

12、si-Negative相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染si-Klotho可使HG、TGF-β1誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞中Egr-1表達(dá)進(jìn)一步升高，p-Smad3/Smad3及(p-ERK1/2)/(ERK1/2)蛋白比值進(jìn)一步升高，si-Klotho的上述作用可被ERK1/2抑制劑PD98059明顯減弱。
　　結(jié)論：
　　1、早期DKD小鼠腎皮質(zhì)中Klotho表達(dá)明顯減少，Egr-1表達(dá)明顯增加，且Klotho表達(dá)水平的降低早期Egr-1表達(dá)水平的升

13、高。
　　2、HG、TGF-β1對HK2細(xì)胞中Klotho表達(dá)的抑制作用呈時(shí)間依賴性，Klotoh在DKD進(jìn)展中對腎小管EMT具有抑制作用。
　　3、HG、TGF-β1可誘導(dǎo)HK2細(xì)胞中Egr-1瞬時(shí)表達(dá)，Egr-1在DKD進(jìn)展中對腎小管EMT具有促進(jìn)作用。
　　4、Klotho通過抑制TGF-β1/Smad3-ERK1/2信號(hào)通路下調(diào)HG、TGF-β1誘導(dǎo)的HK2中Egr-1的表達(dá)，這可能是Klotho在DKD進(jìn)展中