BMP9過(guò)表達(dá)對(duì)甘油三酯代謝的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 BMP9在不同病理模型鼠及人肝臟中的表達(dá)差異
　　目的：
　　探討在NAFLD病人、高脂喂養(yǎng)小鼠及db小鼠肝臟中BMP9mRNA和蛋白的表達(dá)情況。
　　方法：
　　普食喂養(yǎng)（ND）和高脂喂養(yǎng)（HFD）23周的C57BL/6J小鼠各10只、正常人和NAFLD病人、同齡db鼠和野生鼠取肝臟提蛋白和RNA，再經(jīng)Q-PCR和Western blot檢測(cè)BMP9 mRNA和蛋白的表達(dá)差異。
　　結(jié)果：

2、>　　BMP9 mRNA和蛋白表達(dá)量在HFD小鼠、NAFLD病人和db小鼠肝臟中均顯著低于（P＜0.01）相應(yīng)對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　　BMP9基因的表達(dá)可能與機(jī)體脂代謝相關(guān)。
　　第二部分 BMP9表達(dá)上調(diào)對(duì)飽和脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞甘油三酯的影響
　　目的：
　　探討B(tài)MP9表達(dá)上調(diào)對(duì)飽和脂肪酸誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞甘油三酯聚集情況的影響
　　方法：
　　在人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞2，利用

3、飽和脂肪酸FFAs（OA：PA=2：1混合）誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性細(xì)胞模型，根據(jù)細(xì)胞內(nèi)脂滴含量的多少及細(xì)胞狀態(tài)確定合適的 FFAs的作用濃度。同時(shí)，利用BMP9過(guò)表達(dá)腺病毒（Ad-BMP9）過(guò)表達(dá)BMP9的表達(dá)，通過(guò)油紅O染色及細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量的測(cè)定來(lái)檢測(cè)BMP9基因?qū)FAs誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)聚集是否有影響。
　　結(jié)果：
　　在人HepG2肝癌細(xì)胞中，成功誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性模型。根據(jù)油紅O染色結(jié)果確定了FFAs的最適作用濃度為

4、0.25mM；根據(jù)細(xì)胞中熒光表達(dá)情況及BMP9 mRNA和蛋白表達(dá)情況確定BMP9成功過(guò)表達(dá)；BMP9 mRNA的表達(dá)隨著FFAs濃度的增加呈下降趨勢(shì)，與0mM時(shí)比較，0.25mM FFAs時(shí)BMP9的表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。與Ad-GFP組比較，Ad-BMP9組在FFAs誘導(dǎo)的狀態(tài)下脂滴明顯減少（P＜0.01），TG的含量顯著降低（P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　BMP9基因表達(dá)上調(diào)可以減少甘油三酯的聚集。

5、　　第三部分 BMP9過(guò)表達(dá)對(duì)甘油三酯代謝調(diào)節(jié)的可能機(jī)制
　　目的：
　　探討B(tài)MP9在脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂肪變性中對(duì)甘油三酯代謝調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。
　　方法：
　　在人HepG2肝癌細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)BMP9基因，加入0.25mM FFAs誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變性后，通過(guò)Q-PCR和Western blot檢測(cè)脂肪酸從頭合成相關(guān)基因（SREBP1C、FAS、SCD-1、ACC-1）的 mRNA和蛋白的表達(dá)；分析信號(hào)通路AM

6、PK的變化情況；利用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)研究 BMP9在細(xì)胞中表達(dá)的部位；利用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)BMP9基因?qū)REBP1C基因啟動(dòng)子的調(diào)控作用，并尋找可能的結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)果：
　　與Ad-GFP組相比，Ad-BMP9組在FFAs誘導(dǎo)的狀態(tài)下脂肪酸從頭合成相關(guān)基因（SREBP1C、FAS、SCD-1、ACC-1）的mRNA表達(dá)均顯著降低（P＜0.01）；FAS、SCD-1、SREBP1C蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01

7、）；ACC和AMPK的蛋白的磷酸化水平均顯著增加（P＜0.01）；而AMPK的總蛋白水平明顯降低（P＜0.01）。細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明BMP9在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中均有表達(dá)，但細(xì)胞漿中表達(dá)較強(qiáng)，核內(nèi)略弱；雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明BMP9基因可顯著下調(diào)SREBP1C基因啟動(dòng)子的活性（P＜0.05）；將啟動(dòng)子截?cái)嗪筮M(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，BMP9基因調(diào)控SREBP1C基因啟動(dòng)子的結(jié)合區(qū)域可能位于SREBP1C基因啟動(dòng)子-212至-381之間，結(jié)合