MeDIP-seq檢測(cè)游離SiO2所致肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的DNA甲基化.pdf

1、目的:
　　塵肺病是我國(guó)職業(yè)病中占比例最多的疾病，一直以來(lái)影響著發(fā)病者的生活質(zhì)量和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展，而游離 SiO2粉塵致肺纖維化作用最強(qiáng)，矽肺也是塵肺中進(jìn)展最快、死亡率最高的一種之一。長(zhǎng)期以來(lái)，人們對(duì)矽肺進(jìn)行了大量研究，但是其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，因而缺乏有效的早期診斷、動(dòng)態(tài)觀察的生物標(biāo)志，也不能消除或逆轉(zhuǎn)肺組織纖維化。隨著表觀遺傳學(xué)的研究和發(fā)展，表觀遺傳學(xué)調(diào)控可能是矽肺形成中成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的重要機(jī)制。本課題組前期研究在建立細(xì)胞共培

2、養(yǎng)的矽肺體外模型基礎(chǔ)上，通過(guò)高效液相色譜法對(duì)矽肺中肺成纖維細(xì)胞 DNA甲基化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)整體甲基化程度降低，因此認(rèn)為DNA甲基化改變可能是矽肺發(fā)生發(fā)展的一種調(diào)控方式。但并未進(jìn)行甲基化特異性位點(diǎn)的探索和研究，而相關(guān)研究也尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，該研究采用 DNA甲基化免疫共沉淀測(cè)序（MeDIP-seq）技術(shù)對(duì)SiO2所致肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中可能存在的DNA甲基化差異基因進(jìn)行檢測(cè)，并探討其可能的機(jī)制，為進(jìn)一步研究其表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制提供實(shí)

3、驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　本次實(shí)驗(yàn)中采取組織塊法提取雄性 SD大鼠的肺成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)至6-8代時(shí)轉(zhuǎn)移至6孔板中。采用肺泡灌洗術(shù)提取雄性SD大鼠的肺泡巨噬細(xì)胞。使用 transwell對(duì)肺成纖維細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，肺成纖維細(xì)胞在下層，巨噬細(xì)胞在transwell之上，建立矽肺體外模型。使用100μg/ml的SiO2的工作液對(duì)共培養(yǎng)模型的巨噬細(xì)胞進(jìn)行染毒處理，分別在0h（A1）、24h（A2）、48h（A

4、3）收取成纖維細(xì)胞。采用QIAamp DNA Mini Kit試劑盒提取成纖維細(xì)胞的DNA。采用DNA甲基化免疫共沉淀測(cè)序（MeDIP-seq）技術(shù)對(duì)不同組的DNA進(jìn)行DNA甲基化的檢測(cè)，測(cè)序所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)初步的篩選和處理之后用于后續(xù)的分析。分別對(duì)測(cè)序所得reads和高甲基化區(qū)域掃描peak進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述和基因元件分布的描述。進(jìn)一步的對(duì)差異甲基化區(qū)域和差異基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并使用DAVID工具對(duì)DNA甲基化差異基因進(jìn)行GO和KEGG pat

5、hway的生物信息學(xué)分析。使用亞硫酸氫鹽測(cè)序的方法對(duì)MeDIP-seq的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:
　　1. MeDIP-seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)分別有26,048,428（60.90％）、34,162,578（61.53%）、33,314,252（60.18%）個(gè)Reads比對(duì)到了大鼠的參考基因組上，進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，分別有22,192,364、28,930,222、28,256,146個(gè)Reads比對(duì)到參考基因組的唯一位置上。

6、基因組功能原件的分布分析發(fā)現(xiàn)，集中在基因間區(qū)的reads最多，其次是內(nèi)含子和外顯子等。
　　2.掃描顯著性的甲基化 peak區(qū)域，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總共308,723個(gè)peak被掃描發(fā)現(xiàn)，在各組分別有208,253、206,685和232,504個(gè)peak掃描獲得，分別有208,253、206,685、232,504個(gè) peak定位在了基因的功能元件上。在不同的功能元件上，在基因間區(qū)的peak數(shù)量最多，內(nèi)含子次之。
　　3. D

7、NA甲基化差異區(qū)域?qū)?yīng)的唯一差異基因有16,292個(gè)，其中A1與A2的比較組中有13,311個(gè)，A2與A3的比較組中有13,753個(gè)，A1與A3的比較組中有13,381個(gè)，更深入的分析發(fā)現(xiàn)總共有8,791個(gè)基因被發(fā)現(xiàn)在三個(gè)差異組中都存在。
　　4. DNA甲基化差異基因的GO分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要集中在生物學(xué)過(guò)程、構(gòu)成細(xì)胞的組分，實(shí)現(xiàn)的分子功能三個(gè)大的分類(lèi)中。其中4,402個(gè)基因分類(lèi)在生物學(xué)過(guò)程中，3,920個(gè)基因分類(lèi)在細(xì)胞組成

8、成份，4,290個(gè)基因分類(lèi)在分子功能中。
　　5. DNA甲基化差異基因的KEGG pathway分析發(fā)現(xiàn)，這些差異甲基化基因主要富集在37個(gè)通路中，這37個(gè)通路按照其特征又歸化為了5個(gè)大類(lèi)的通路，包括新陳代謝、環(huán)境信息加工、細(xì)胞過(guò)程、生物體系統(tǒng)和人類(lèi)疾病相關(guān)的通路。
　　結(jié)論:
　　成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中涉及的DNA甲基化改變的位點(diǎn)主要分布在基因的基因間區(qū)和內(nèi)含子、外顯子區(qū)域，啟動(dòng)子和基因下游區(qū)域很少。
　　成

9、纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中存在大量DNA甲基化程度發(fā)生改變的基因，這些基因的功能主要集中在與磷代謝相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程、質(zhì)膜相關(guān)的細(xì)胞組成成份和離子通道相關(guān)的分子功能中。
　　成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程可能與線粒體的能量活動(dòng)有關(guān)；成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化后形成肺纖維化的主要形式是成纖維細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的連接形成粘著斑；成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中有與突觸形成相關(guān)基因的功能變化變化；成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程與癌癥形成有許多相似的過(guò)程，其中的MAPK、Wnt、ErbB