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文檔簡介
1、目的:觀察硫酸鈹(BeSO4)刺激下人胚肺成纖維細胞(MRC-5)中胸腺細胞分化抗原-1(Thy-1)DNA甲基化改變情況,Thy-1mRNA及蛋白的變化,纖維化相關(guān)因子膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ、α-SMA mRNA及蛋白的改變,探討Thy-1DNA甲基化在BeSO4致肺纖維化中的作用。用甲基化轉(zhuǎn)移酶酶抑制劑5-氮雜胞苷(AZC)干預(yù)MRC-5進一步驗證Thy-1DNA甲基化變化。使用組蛋白乙?;敢种苿┣乓志谹(TSA),觀察MRC
2、-5中是否同時存在組蛋白乙?;?。同時觀察在這兩種抑制劑的作用下,纖維相關(guān)因子和Thy-1的表達情況。
方法:建立離體MRC-5培養(yǎng)實驗?zāi)P停越K濃度分別為1.0、10.0、100.0μmol/L的BeSO4染毒(設(shè)為低、中、高劑量組),對照組不作染毒處理;另設(shè)AZC干預(yù)組,終濃度為10.0μmol/L的硫酸鈹和10.0μmol/L AZC混合液處理組(BeSO4+AZC組)和TSA干預(yù)組,終濃度為10.0μmol/L的硫酸鈹和
3、0.5μmol/L TSA混合液處理組(BeSO4+TSA組)。分別在染毒24、48和72h后收集細胞,采用實時定量式聚合酶鏈式反應(yīng)檢測膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和Thy-1mRNA相對表達水平;巢式降落式甲基化特異性聚合酶鏈式反應(yīng)檢測Thy-1DNA甲基化水平;蛋白免疫印跡法(western-blot)檢測膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ、α-SMA和Thy-1蛋白的相對表達水平。
結(jié)果:1.MRC-5細
4、胞中膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ和α-SMA的mRNA的蛋白相對表達水平均呈隨染毒劑量增加而增加的趨勢(P<0.05或P<0.01));低、中、高劑量組膠原蛋白Ⅰ、膠原蛋白Ⅲ和α-SMA的mRNA和蛋白相對表達水平均呈隨著染毒時間的增加而升高的趨勢(P<0.05或P<0.01));AZC和TSA干預(yù)后,24、48、72h時間點,BeSO4+AZC組、BeSO4+TSA組3個指標的蛋白相對表達水平均低于中劑量組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)
5、;
2.24、48、72h時間點上,中、高劑量組Thy-1DNA甲基化水平均高于對照組(P<0.05或P<0.01);低、中、高劑量組Thy-1DNA甲基化水平呈隨染毒劑量增加而增加趨勢(P<0.05);AZC和TSA干預(yù)后,48、72h時間點上,BeSO4+AZC組、BeSO4+TSA組Thy-1DNA甲基化水平均低于中、高劑量(P<0.05);
3.24、48、72h時間點上,低、中、高劑量組MRC-5細胞Thy
6、-1mRNA和蛋白的相對表達水平均低于對照組(P<0.01或P<0.01);AZC和TSA干預(yù)后,48、72h時間點上,BeSO4+AZC組、BeSO4+TSA組Thy-1蛋白的相對表達水平均高于中劑量組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
結(jié)論:在硫酸鈹刺激下可導(dǎo)致MRC-5細胞纖維化的發(fā)生,該過程中Thy-1DNA甲基化程度升高,Thy-1mRNA表達水平降低,可能是硫酸鈹致肺纖維化的重要機制之一,在該過程中可能同時存在組
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