hASCs及其CM對大鼠皮膚燒傷修復(fù)的作用與機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　觀察并比較人脂肪干細(xì)胞(human adipose-derived stem cells, hASCs）、脂肪干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（human adipose-derived stem cells-conditioned medium, hASCs-CM）和大鼠成纖維細(xì)胞（dermal fibroblast, DF）對皮膚燒傷的修復(fù)作用，尋找脂肪干細(xì)胞修復(fù)皮膚作用中的關(guān)鍵分子和可能的干預(yù)因素。
　　方法：
　　

2、1.利用膠原酶消化法對ASCs進(jìn)行分離培養(yǎng)，繪制細(xì)胞生長曲線；應(yīng)用流式細(xì)胞儀對P2、P3、P5的ASCs進(jìn)行表面標(biāo)志物檢測；應(yīng)用誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基對ASCs向成脂、成軟骨和成骨方向進(jìn)行誘導(dǎo)分化，分化后分別行油紅O、阿爾辛藍(lán)和茜素紅特殊染色鑒定；應(yīng)用免疫熒光技術(shù)和PT-PCR技術(shù)對P1、P2、P5、P6細(xì)胞中Oct4和Sox2的表達(dá)情況進(jìn)行分析。
　　2.收集獲得正常、高碳酸和TGF-β1誘導(dǎo)三種培養(yǎng)條件下的hASCs-CM，檢測hAS

3、Cs-CM中分泌的多種生長因子VEGF、bFGF、 IGF-1和EGF。數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。
　　3.膠原酶 P消化法培養(yǎng)新生小鼠真皮層成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行傳代、凍存和復(fù)蘇。
　　4.選用200±20g的SD大鼠，建立III度燒傷模型。隨機(jī)分為鹽水對照組、MDF移植對照組、hASCs組、hASCs-CM組檢測大鼠皮膚損傷修復(fù)情況。同時(shí)在7d、15d、21d和28d采集標(biāo)本，并進(jìn)行拍照。行HE染色觀察大

4、鼠燒傷皮膚組織的病理結(jié)構(gòu)，通過圖像分析軟件比較創(chuàng)面愈合率。
　　5.用抗人線粒體抗體檢測燒傷組織中人線粒體表達(dá)，進(jìn)一步了解hASCs在損傷組織的分布情況。分別采集7d、15d、21d和損傷皮膚用免疫組化方法檢測MMP1、MMP9、III、Ⅳ型膠原蛋白的表達(dá)情況，并用IPP6.0軟件測OD值進(jìn)行半定量分析，結(jié)果采用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析。
　　結(jié)果：
　　1.原代及傳代培養(yǎng)ASCs呈成纖維樣貼壁生長，形態(tài)均一，

5、細(xì)胞群體倍增時(shí)間為31h。各代ASCs均表達(dá)CD29、CD44、CD90和CD105，不表達(dá)CD34和CD45，也不表達(dá)CD8a、CD56和CD69；成脂、成軟骨和成骨誘導(dǎo)后染色鑒定結(jié)果均為陽性；Oct4在P1、P2細(xì)胞中的表達(dá)位于細(xì)胞核內(nèi),而在P5、P6細(xì)胞的表達(dá)則位于胞質(zhì)；Sox2在P1、P2細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)，而在P5、P6細(xì)胞的胞質(zhì)中幾乎不表達(dá)。Oct4隨著傳代次數(shù)表達(dá)是逐漸減少的，Sox2在 P1、P2細(xì)胞中可檢測到RNA的表達(dá)

6、，P5、P6細(xì)胞中無RNA表達(dá)。
　　2.與正常對照組比較，高碳酸環(huán)境組和TGF-β1組的ASCs-CM的VEGF、EGF、bFGF和IGF-1的含量明顯增多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；TGF-β1組與高碳酸環(huán)境組的VEGF、bFGF和 IGF-1相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），EGF組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.086）。
　　3.新生小鼠背部皮膚經(jīng)酶消化法后12-36h有貼壁細(xì)胞。細(xì)胞呈短梭形、多角形或

7、不規(guī)則形。2～3 d后細(xì)胞數(shù)量迅速增加成75％-90%匯合，傳代細(xì)胞逐漸變?yōu)殚L梭形，胞質(zhì)向外伸出偽足，細(xì)胞核呈卵圓形，居中。傳代后細(xì)胞形態(tài)較為均一，排列規(guī)則，呈平行狀、放射狀、旋渦狀生長。
　　4.統(tǒng)計(jì)燒傷創(chuàng)面的愈合率，結(jié)果表明細(xì)胞移植14d后，ASCs移植治療組的愈合率為47.63%與ASCs-CM組(40.18%)、MDF組(37.85%)和鹽水對照組（31.83%）相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。在21d和28d與鹽水組

8、相比，ASCs-CM組和DF組有一定的促進(jìn)作用。ASCs移植組的皮膚愈合速度最快，肉芽組織成熟，膠原排列整齊，毛細(xì)血管較少，皮膚結(jié)構(gòu)層次較清晰，且表面有毛長出。這提示ASCs在燒傷修復(fù)中有著很強(qiáng)的促進(jìn)作用。
　　5.隨著時(shí)間的推移，ASCs主要分布在創(chuàng)面。ASCs組在14d和21d III型膠原的表達(dá)量高于其他組，但7d時(shí)的表達(dá)量與其他組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ASCs組在14d和21d MMP1的表達(dá)量高于其他組，但7d時(shí)的表達(dá)量與其他組

9、無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不同時(shí)間點(diǎn)各組的Ⅳ型膠原表達(dá)量較少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組不表達(dá)MMP9。
　　結(jié)論：
　　1.通過對脂肪干細(xì)胞（ASCs）的原代及傳代培養(yǎng)，研究了多能性分子Oct4和Sox2在ASCs中的表達(dá)，為ASCs的優(yōu)化培養(yǎng)提供了線索和依據(jù)。
　　2.在高碳酸環(huán)境和 TGF-β1誘導(dǎo)下，ASCs-CM中的生長因子含量均升高，而TGF-β1作用更明顯，對ASCs-CM應(yīng)用于臨床提供了理論依據(jù)。
　　3. AS

10、Cs移植組的皮膚愈合速度最快，皮膚結(jié)構(gòu)層次較清晰，且表面有毛長出。這提示ASCs在燒傷修復(fù)中有著很強(qiáng)的促進(jìn)作用。
　　4. ASCs通過上調(diào)III型膠原和MMP1的表達(dá)，減少Ⅰ型膠原的合成和瘢痕形成，改善了Ⅰ/III型膠原的比例，促進(jìn)燒傷的修復(fù)，為后續(xù)研究提供了思路和線索。
　　5.在燒傷修復(fù)的早中期，各組表達(dá)少量的Ⅳ型膠原，不表達(dá) MMP9。由于Ⅳ型膠原在表皮功能的重塑和瘢痕形成中有著重要的作用。后續(xù)研究中可延長時(shí)間觀察其