AhR-E2F1-KGFR信號通路參與KGF誘導的腸上皮細胞增殖的機制研究.pdf

1、背景與目的：腸上皮細胞(intestinal epithelial cells，IEC)和腸上皮間淋巴細胞(intraepitheliallymphocytes，IELs)之間的相互作用在腸上皮的生長、結(jié)構(gòu)和功能維持方面發(fā)揮著重要作用。角質(zhì)細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)屬于成纖維細胞生長因子家族成員，在腸道組織中由黏膜層的γδ上皮間淋巴細胞(γδ intraepithelial lympho

2、cytes，γδ-IELs）分泌產(chǎn)生，與膠質(zhì)細胞生長因子受體(keratinocyte growth factor receptor，KGFR)結(jié)合后以旁分泌的形式促進腸上皮細胞的生長和增殖。我們之前曾經(jīng)報道過，在體內(nèi)實驗中，給小鼠腹腔注射外源性的KGF后，KGF可以通過促進腸上皮細胞的增殖來緩解小腸缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)帶來的損傷以及輻射誘導的腸道損傷，從而起到保護腸道的作用。研究還表明，在胃腸

3、道中KGFR的表達量非常豐富，這些發(fā)現(xiàn)提示消化道不僅可以合成、分泌KGF，而且可以對KGF產(chǎn)生反應。
　　最近有學者使用斑馬魚模型進行研究發(fā)現(xiàn)，芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)在KGF誘導的組織再生中具有重要作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在鼠科動物的3T3成纖維細胞中，AhR的表達可以受到成纖維細胞生長因子家族成員(fibroblast growth factor,FGF)的調(diào)控。這些研究都提示我們

4、，內(nèi)源性的AhR可能參與到了FGF介導的信號通路中，從而在細胞或組織的生長、增殖中發(fā)揮作用。
　　AhR作為一種DNA結(jié)合蛋白，由805個氨基酸構(gòu)成，屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basichelix-loop-helix，bHLH)超家族，在人體多種器官和組織、細胞中都有表達。非配體化的AhR在胞漿中可以和熱休克蛋白90(heat shock protein，HSP90)結(jié)合形成一個穩(wěn)定的復合體，當AhR被其內(nèi)源性或外源性配體激活后遂

5、與HSP90分離，AhR-配體復合體轉(zhuǎn)移到核內(nèi)并迅速與AhR核轉(zhuǎn)位子(AhRnucleartranslocator，ARNT)結(jié)合到二噁英反應元件上，進而反式激活編碼異性生物質(zhì)代謝酶Ⅰ、Ⅱ的基因，比如細胞色素P450s。近幾十年來，大家已經(jīng)圍繞AhR介導的毒性效應進行了大量的研究。越來越多的證據(jù)表明，AhR可能在受體介導的信號通路中扮演著重要角色。比如，Lee等人曾經(jīng)在野生型和AhR基因敲除型（AR-/-）小鼠的RorγT+細胞中通過微

6、陣列芯片分析技術發(fā)現(xiàn)Notch1是AhR的一個下游作用靶點。另外，Qiu等人研究發(fā)現(xiàn)，通過敲除AhR基因可以明顯降低白介素7受體α(Interleukin-7 receptorα，IL-7Rα)的表達，Kiss等人也曾經(jīng)報道稱在敲除AhR基因的固有淋巴細(innate lymphoid cells，ILCs)中，編碼具有酪氨酸蛋白激酶活性的生長因子受體的原癌基因cKit的表達量顯著下降?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們推測內(nèi)源性的AhR可能是通過調(diào)節(jié)

7、KGFR的表達從而影響KGF介導的信號通路的。
　　方法:
　　一、成年(6-8周)C57BL/6J小鼠和C57BL/6J AhR-/-小鼠均被隨機分成四組:對照組、KGF干預組、AhR-/-+KGF組、AhR-/-組，每組包括6只小鼠。KGF藥物干預第五天處死小鼠并取小腸進行分析。通過增殖細胞核抗原(Proliferati ng Cell Nuclear Antigen，PCNA)免疫組織化學來檢測上皮細胞(epithel

8、ial cell，EC)的增殖情況，通過蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色來反映小腸的組織形態(tài)學變化，通過檢測絨毛高度、隱窩深度、小腸濕重、RNA及蛋白質(zhì)含量等指標來反映不同組別小腸的變化。
　　二、通過免疫印跡(western blot，WB)技術檢測成年(6-8周)C57BL/6J小鼠和C57BL/6JAhR-/-小鼠的小腸上皮AhR蛋白表達水平，從而評估AhR基因敲除效果。通過WB和實時熒光定量聚合

9、酶鏈反應(Real-time Polymerase Chain Reaction，Real-time PCR)技術來檢測對照組和AhRKO組小腸上皮中KGFR的表達水平。
　　三、使用針對AhR的小干擾RNA(siAhR)沉默LoVo細胞中的AhR基因，細胞分為對照組、轉(zhuǎn)染siNC組、siAhR組等三組。AhR的表達通過WB檢測，KGFR的表達水平通過WB和Real-timePCR檢測。分別提取核蛋白和總蛋白后，通過WB檢測E2F

10、1的表達水平。
　　四、使用針對E2F1的小干擾RNA(siAhR)沉默LoVo細胞中的E2F1基因，細胞分為三組，即對照組、轉(zhuǎn)染siNC組、siE2F1組，利用WB技術檢測三組細胞中E2F1和KGFR的表達水平。
　　五、對LoVo細胞進行KGF和/或siAhR干預處理，分為四組，即DMSO組、KGF干預組、siAhR干預組、KGF+siAhR組。通過細胞計數(shù)和流式細胞周期分析等實驗手段對LoVo細胞進行增殖方面的研究。<

11、br>　　結(jié)果:
　　1、與對照組相比，KGF干預組的小腸組織PCNA陽性細胞數(shù)量顯著升高，而AhR-/-組KGF誘導的腸上皮增殖細胞數(shù)量顯著降低。與KGF干預組相比，敲除AhR基因?qū)е驴漳c的絨毛高度顯著下降、隱窩深度顯著變淺，小腸濕重以及RNA、蛋白質(zhì)的含量也明顯降低（*P＜0.05）。
　　2、經(jīng)檢測AhR-/-組小鼠小腸上皮組織內(nèi)AhR含量可以發(fā)現(xiàn)AhR已成功敲除。生理狀態(tài)下，無論是蛋白水平還是mRNA水平，敲除AhR

12、基因都導致了腸上皮細胞內(nèi)KGFR的表達量顯著降低(*P＜0.05)。
　　3、通過WB檢測AhR的表達水平發(fā)現(xiàn)，在使用siAhR的組中，AhR基因被成功沉默。WB及Real-timePCR結(jié)果顯示，與對照組相比，AhR基因沉默的細胞KGFR在蛋白水平和mRNA水平均顯著降低。利用WB檢測E2F1蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)，在核蛋白中，siAhR組E2F1與其他組相比，表達水平顯著降低，而在總蛋白中，三組表達水平并無顯著性差異(*P＜0.05

13、)。
　　4、利用WB檢測E2F1蛋白發(fā)現(xiàn)LoVo細胞被成功轉(zhuǎn)染siE2F1。WB及Real-timePCR結(jié)果顯示，E2F1基因沉默的細胞內(nèi)KGFR的表達水平與其他組相比顯著下降(*P＜0.05)。
　　5、通過細胞計數(shù)發(fā)現(xiàn)，KGF組的細胞數(shù)量顯著高于其他組。流式細胞周期分析結(jié)果顯示KGF組被阻滯在G0/G1期的細胞數(shù)量顯著低于其他組，而處于S期的細胞數(shù)量則顯著高于其他組(*P＜0.05)。
　　結(jié)論:
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