細胞色素CYP3A11knock-dwon小鼠的表達檢測及表型分析.pdf

1、細胞色素P450(cytochrome，CYP450)是參與藥物代謝的一類非常重要的代謝酶，在多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的生物代謝中起著重要作用。大約60％的普通處方藥都需要通過P450酶進行生物轉(zhuǎn)化。CYP3A是CYP450中最重要的亞家族成員之一，參與丙源性物質(zhì)的生物合成、代謝以及外源性物質(zhì)的氧化代謝。據(jù)國外研究報道在CYP3A亞家族中，CYP3A11是小鼠含量最豐富的亞型，且是小鼠肝臟表達量最高(占小鼠肝臟P450酶總體表達量的20％

2、)、代謝活性最強的P450酶，然而其在藥物代謝中的作用還沒有完全被世人所知。為了充分發(fā)揮藥物療效，減少或避免不良反應的發(fā)生，需要對CYP3A11的表達進行更深入的研究。
　　 Knock-down是在藥物代謝研究中應用最廣泛的特異性改變蛋白表達的一類新技術。本文在前期采用該技術制備的CYP3A11knock-down小鼠基礎上，以單線法連續(xù)繁殖至第3代的近交系小鼠為實驗動物，通過R-TPCR、FQ-PCR和微粒體外孵育等分子生物

3、學方法研究了CYP3A11轉(zhuǎn)基因小鼠在連續(xù)傳代過程中的表達情況、miR-shRNA對CYP3A11轉(zhuǎn)基因小鼠的干擾效率和CYP3A11轉(zhuǎn)基因小鼠表型分析，為以后利用慢病毒載體制作其它小鼠模型和大型轉(zhuǎn)基因哺乳動物提供理論依據(jù)，同時為建立代謝譜更廣、適用范圍更大的P450酶人源化轉(zhuǎn)基因小鼠奠定基礎。研究主要結(jié)果如下：
　　 1.采用PCR和RT-PCR相結(jié)合的方法定性鑒定了連續(xù)3代轉(zhuǎn)基因小鼠的陽性率。結(jié)果表明：單線近交繁育的轉(zhuǎn)基因小

4、鼠陽性率和表達率均為100％，此結(jié)果說明轉(zhuǎn)基因動物在單線近交繁殖群體中并未出現(xiàn)基因分離現(xiàn)象，可以通過此方法建立穩(wěn)定的陽性轉(zhuǎn)基因品系。
　　 2.紫外燈下可觀察到小鼠耳廓皮膚及尾巴的EGFP特征性綠色熒光，該結(jié)果表明目的基因已在小鼠體內(nèi)表達。
　　 3.通過熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示在肝臟中miR-shRNA對CYP3A11轉(zhuǎn)基因小鼠的干擾效率最高可達80％左右，表明由慢病毒介導的miRNA分子也得以表達并因此顯著地減少

5、了目的基因的表達。
　　 4.對CYP3A11基因knock-down小鼠表型分析采用肝臟微粒體體外代謝活性檢測方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)knock-down小鼠的肝臟微粒體對CYP3A11酶的經(jīng)典底物6β-羥基睪酮的代謝活性比對照組降低了80％以上；表達無關對照shRNA轉(zhuǎn)基因小鼠與正常FVB/N小鼠的CYP3A11酶的體外代謝活性無顯著差異，表明慢病毒介導的轉(zhuǎn)基因過程對CYP3A11酶的活性無顯著差異，與基因表達的降低幅度相當。