熊果酸經(jīng)SFRP4-Wnt-β-catenin-Foxo3a-p27通路調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖.pdf

1、目的：從SFRP4/Wnt/β-catenin/FoxO3a/p27通路的角度，研究熊果酸（UA）對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞增殖的抑制作用。
　　方法：復(fù)制SD大鼠高脂血癥模型，免疫組化技術(shù)檢測(cè)其胸主動(dòng)脈壁SFRP4的蛋白表達(dá)；復(fù)制 AngⅡ（0.1μM）誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞增殖模型，實(shí)驗(yàn)分組為：正常對(duì)照組，AngⅡ模型組，UA組（5μM，10μM，20μM），UA組均預(yù)給藥12h后加入AngⅡ造模24h，CCK-8法檢測(cè)該時(shí)間點(diǎn)細(xì)

2、胞增殖活性；RT-PCR和western blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞SFRP4、β-catenin、FoxO3a、p27的mRNA和蛋白水平；免疫熒光技術(shù)觀(guān)測(cè)β-catenin的胞內(nèi)定位；首次應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，驗(yàn)證A7r5細(xì)胞通路級(jí)聯(lián)關(guān)系及UA的作用靶標(biāo)，設(shè)計(jì)分組：AngⅡ模型組、模型+si-SFRP4組、模型+Wnt通路抑制劑XAV939（5μM，預(yù)孵育4h）組、UA組（20μM）、UA+si-SFRP4組、UA+Wnt通路激活劑Li

3、Cl（500μM，預(yù)孵育4h）組；Western blot技術(shù)檢測(cè)干擾效率和目的蛋白表達(dá)；采用SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果：①動(dòng)物學(xué)研究：免疫組化技術(shù)結(jié)果顯示，大鼠胸主動(dòng)脈壁存在SFRP4蛋白，且正常組的SFRP4光密度比值高于模型組（P<0.05）；②細(xì)胞學(xué)研究：CCK-8結(jié)果顯示，0.1μM AngⅡ誘導(dǎo)24h顯著提高細(xì)胞增殖率，而分別加入5μM、10μM、20μM UA預(yù)保護(hù)12h，均有明顯的細(xì)胞增殖抑制作

4、用（P<0.05）；模型+si-sFRP4組的增殖率較模型組升高，且UA+si-SFRP4組增殖率較UA組增高（P<0.05），提示SFRP4與該細(xì)胞增殖呈負(fù)相關(guān)，且隨SFRP4表達(dá)減少，UA的抗增殖活性減弱。模型組的SFRP4、FoxO3a、p27的mRNA和蛋白水平較正常對(duì)照組均下降，F(xiàn)oxO3a蛋白磷酸化水平升高，且β-catenin的mRNA和蛋白水平升高（P<0.05），免疫熒光結(jié)果顯示，β-catenin蛋白表達(dá)核內(nèi)增多，提

5、示AngⅡ誘導(dǎo)Wnt/β-catenin通路的激活；加入si-SFRP4后，模型組SFRP4蛋白表達(dá)缺失，β-catenin蛋白表達(dá)升高（P<0.05），提示SFRP4負(fù)性調(diào)控β-catenin；與模型組相比，模型+XAV939組β-catenin、p-FoxO3a蛋白表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)oxO3a、p27表達(dá)增多（P<0.01），提示FoxO3a、p27受上游分子β-catenin的調(diào)控，綜上即A7r5細(xì)胞增殖中存在SFRP4/Wnt/β-c

6、atenin/FoxO3a/p27信號(hào)軸的調(diào)控。UA組SFRP4、FoxO3a、p27的mRNA水平和蛋白表達(dá)均較模型組升高，β-catenin的mRNA和蛋白水平下降，β-catenin蛋白的核內(nèi)表達(dá)顯著減少，p-FoxO3a表達(dá)下調(diào)（P<0.05），提示UA可抑制Wnt通路的激活，上調(diào)下游轉(zhuǎn)錄因子；經(jīng)si-SFRP4處理后，UA組SFRP4蛋白表達(dá)沉默，β-catenin的蛋白表達(dá)升高（P<0.05），提示UA抑制Wnt通路涉及到上