人參皂苷Rg1選擇性激動甾體激素受體抗Aβ25-35致原代皮層神經元損傷與促胚胎干細胞衍生神經元研究.pdf

1、胚胎干(Embryonic stem，ES)細胞能在體外長期傳代培養(yǎng)并保持高度未分化狀態(tài)，而給予適宜培養(yǎng)條件后，可在體外分化為不同胚層源性的任何類型細胞。雖然其具有分化全能性，但要應用于再生醫(yī)學，僅有細胞來源是不夠的，如何調控細胞命運，特別是干細胞的分化命運，才是科學界亟待解決的重大課題1，12，20。
　　 人參是著名的補益中藥，應用于中醫(yī)臨床已有兩千多年的歷史，具有廣泛的藥理作用和醫(yī)療用途。近年來，大量研究已證實人參皂苷Rg

2、l是人參作用于中樞神經系統(tǒng)的主要活性成分之一，具有廣泛的神經保護和神經營養(yǎng)作用，但其具體作用機制迄今未明5。Rgl有類似甾體激素的剛性甾體母核，且體外實驗也發(fā)現(xiàn)其具有雌激素樣和糖皮質激素樣的活性7，8。大量文獻報道甾體激素，如雌激素，孕激素和糖皮質激素等，均具有顯著的神經保護和促智作用，因此推測Rgl的神經。保護和神經營養(yǎng)作用可能與甾體激素受體的激動相關。本論文采用原代培養(yǎng)大鼠皮層神經元和小鼠ES細胞體外分化神經元兩個模型，深入探討了人

3、參皂苷Rgl在神經保護和神經分化兩方面的活性和可能機制，為其在防治神經系統(tǒng)疾病中的進一步應用提供理論支持。
　　 Junctophilin(JP)蛋白家族，是一類存在于可興奮細胞中的新型膜結合蛋白，在進化上高度保守21，其分布具有組織特異性，JP-3和JP-4屬于神經亞型，在大腦皮層、海馬及小腦表達豐度很高18。文獻報道，JP-3，-4基因雙敲除的小鼠呈現(xiàn)運動協(xié)調功能失常和記憶認知功能損傷，提示這兩種蛋白與動物的運動和記憶功能密

4、切相關，但其在動物胚胎發(fā)育過程中的表達變化及功能特征尚未見報道，且兩個亞型在分布和功能上的具體差異也尚未探明。本研究第三部分采用小鼠ES細胞體外分化為神經細胞體系，模擬神經的發(fā)生發(fā)育過程，考察JP-3，-4蛋白在分化所得各類神經細胞中的的表達特征，及其在ES細胞體外分化為神經元過程中的作用，旨在揭示JP-3，-4在神經分化發(fā)育過程中的生命現(xiàn)象本質，并探尋新的促神經再生藥物作用靶點。
　　 1.人參皂苷Rgl對Aβ25-35所致原

5、代大鼠皮層神經元損傷的保護作用(該部分內容已發(fā)表于Neuropharmacology)
　　 β淀粉樣肽(β-amyloid，Aβ)是在阿爾茨海默(Alzheimer's disase，AD)患者腦中發(fā)現(xiàn)的一種多肽，具有明顯的神經毒性，目前認為是導致患者神經元變性和丟失的重要原因。本部分實驗采用Aβ毒性片斷Aβ25-35損傷原代培養(yǎng)大鼠皮層神經元的毒性模型，探討了人參皂苷Rgl對Ap25-35所致神經元損傷的保護作用和相關機制，

6、并明確各甾體激素受體在其中所扮演的角色。結果發(fā)現(xiàn)Rgl能劑量依賴性地對抗Aβ的神經毒性，其中20μmol/L為其作用的最佳濃度。Rgl孵育可引起雌激素受體α(ERα)和糖皮質激素受體(GR)的核轉位，但對雌激素受體β(ERβ)和孕激素受體(PR)無作用，且其與ERα和GR結合的IC50分別為8.6μmol/L和12.8μmol/L，提示Rgl具有體外選擇性激動ERα和GR的作用。siRNA實驗進一步證實基因沉默原代神經元的ERα和GR，

7、可阻斷Rgl的神經保護作用，表明Rgl的保護作用是通過選擇性活化ERα和GR實現(xiàn)的，明確了Rgl的具體作用靶點。
　　 Aβ可引起原代神經元中活性氧(ROS)和NO生成，線粒體膜電位和ERK磷酸化下降，NF-κB激活，過氧亞硝酸根產生，進而導致神經元蛋白酪氨酸硝基化損傷和細胞凋亡，上述損傷現(xiàn)象均可被Rgl逆轉或減輕。除了抗氧化效應，Rgl的上述神經保護作用均通過激動ERα和GR，進而啟動下游信號網絡調控，而其抗氧化作用可能與自身

8、的自由基清除能力相關。上述結果提示，經由ERα和GR活化的抗酪氨酸硝基化.線粒體凋亡通路是Rgl神經保護作用的重要機制之一。
　　 2.人參皂苷Rgl誘導小鼠ES細胞定向分化為神經細胞的研究
　　 近年來發(fā)現(xiàn)，某些小分子化合物能通過作用于特定靶點，調控細胞的增殖和分化，因此，新型小分子探針的發(fā)現(xiàn)將為細胞移植，體細胞重編程和干細胞分化研究帶來新的活力和希望12，20。除了上述顯著的神經保護活性，Rgl還具有調節(jié)神經祖細胞增

9、殖的作用22，23，但其是否能影響神經分化尚未探明。本部分實驗中，我們考察了人參皂苷Rgl促小鼠ES細胞體外分化為神經細胞的作用，并對相關信號通路進行了初步探索。
　　 結果發(fā)現(xiàn)，10μmol/L Rgl共孵育能促小鼠ES細胞體外分化為神經樣細胞，顯著提高分化所得細胞中神經前體細胞和神經元的比例，并上調神經標志性蛋白的表達量。此外，免疫熒光和western blot的結果均證實ES細胞中糖皮質激素受體(GR)的表達呈持續(xù)上調趨勢

10、。GR拮抗劑RU486可有效抑制Rgl促神經分化的作用。同時，Rgl還能提高ERK和Akt的磷酸化水平，且此作用也可被RU486所拮抗。為驗證ERK與Akt是否參與Rgl的促神經分化過程，進一步采用MEK抑制劑U0126和P13K抑制劑LY294002，結果顯示兩者均可有效抑制Rgl的促神經分化作用，且U0126也可一定程度抑制Akt的磷酸化水平。上述結果提示，人參皂苷Rgl具有促小鼠ES細胞體外分化為神經元的作用，此作用經由GR-ME

11、K-ERK1/2-PI3K-Akt通路實現(xiàn)。
　　 3.小鼠ES細胞衍生神經元JP-3，-4的表達及功能特征研究
　　 本研究第三部分采用小鼠ES細胞體外分化為神經細胞體系，模擬神經的發(fā)生發(fā)育過程，考察JP-3，-4蛋白的表達特征，及其在ES細胞體外分化為神經元過程中的作用。實時定量PCR和western blot法檢測分化各階段JP-3，-4基因和蛋白表達情況，結果表明無論是基因層面還是蛋白層面，JP-3，-4均呈現(xiàn)先

12、上升后下降的表達趨勢，其中JP-3的一過性高峰出現(xiàn)在貼壁分化的第5天(d8+5)，而JP-4的高峰則在d8+0，提示兩者脈沖式的表達可能在ES細胞定向分化為神經細胞早期具有特定的生物學意義。進一步采用免疫細胞化學法和流式細胞術考察JP-3，-4的分布，結果顯示在分化所得的細胞類型中包含神經元、星型膠質細胞和少突膠質細胞，JP-3，-4雖在星型膠質細胞中有一定程度的表達，但絕大部分存在于神經元中。同時，也發(fā)現(xiàn)分化所得的神經元中存在膽堿能神

13、經元、谷氨酸能神經元和GABA能神經元，JP-3，-4在這三類亞型神經元中的表達量也有所不同，在谷氨酸能神經元中表達最多，膽堿能神經元中其次，而GABA能神經元中最少。
　　 為考察分化所得神經元中的JP-3，-4是否具有其固有的維持細胞內鈣穩(wěn)態(tài)的功能，進一步對分化所得的神經元進行小干擾實驗，利用活細胞工作站，動態(tài)觀測與JP-3，-4密切相關的內質網鈣離子釋放過程。結果顯示si-JP-3，-4后，蘭尼堿受體增敏劑咖啡因誘發(fā)的鈣離

14、子誘導的鈣離子釋放(Ca2+-induced Ca2+release，CICR)過程雖存在，但明顯受到抑制，而JP-3，-4雙干擾后，CICR則被完全阻斷，提示ES分化所得神經元中的JP-3，-4均具有其固有的維持胞內鈣離子平衡的功能。
　　 另一方面，既然JP-3，-4在分化早期呈現(xiàn)一過性上調的表達趨勢，且此表達高峰的時間窗基本出現(xiàn)在神經前體細胞期，提示JP-3，-4表達可能與ES細胞的神經分化相關。為驗證這一假說，本實驗進一

15、步采用RNA小干擾(siRNA)技術，沉默ES細胞中JP-3，-4的表達，目的在于抑制JP-3，-4的脈沖式表達，結果發(fā)現(xiàn)si-JP-3，-4的神經元分化率及神經標志性蛋白表達量均顯著低于陰形序列對照組，且JP-4基因沉默對神經分化的抑制作用強于JP-3，提示JP-3，-4在ES細胞體外分化為神經元過程中起到重要作用。
　　 結論：
　　 1.人參皂苷Rgl具有抗Aβ25-35所致原代培養(yǎng)大鼠皮層神經元損傷的作用，該作用

16、與選擇性激動ERα和GR相關，其下游分子機制包括上調ERK磷酸化，抑制NF-κB激活，減少蛋白硝基化損傷和阻斷線粒體凋亡通路等。
　　 2.人參皂苷Rgl具有誘導小鼠ES細胞體外分化為神經元的作用，具體作用機制與啟動GR-MEK-ERK1/2-PI3K-Akt信號通路相關。
　　 3.小鼠ES細胞體外分化所得神經元表達功能性的JP-3，-4，其主要分布于谷氨酸能神經元中，其次為膽堿能神經元，再次為GABA能神經元。在分化