新型防御素類雜合肽對(duì)THC8307結(jié)腸癌細(xì)胞系的作用研究.pdf

1、目的：利用抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)人工設(shè)計(jì)合成新型防御素類雜合肽，并研究新型肽對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤作用及作用機(jī)制，為臨床發(fā)現(xiàn)療效更高、毒性更小的抗腫瘤新藥提供指導(dǎo)。
　　方法：1.利用抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出具有抗腫瘤作用的人LL-37、HNP-1、蛙皮素Maximin1和Dermaseptin-B2抗菌肽，經(jīng)Genbank、DNASTAR生物信息學(xué)軟件分析，選取結(jié)構(gòu)合理、理論上活性最佳的抗菌肽氨基酸序列并進(jìn)行個(gè)別氨基酸的置換，增加抗菌肽的靜電荷數(shù)，

2、合成新型的雜合抗菌肽。
　　2.采用ProtParam、Antheprot軟件和chembio office2008分析新型防御素類雜合肽的理論等電點(diǎn)、親水性、不穩(wěn)定性等性質(zhì)，并對(duì)肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)模擬。
　　3.用不同濃度的新型防御素類雜合肽處理人肺癌細(xì)胞（A549）、人結(jié)腸癌細(xì)胞（THC8307）、嗜鉻神經(jīng)細(xì)胞瘤（PC12），分別作用24h、48h后終止刺激，采用實(shí)時(shí)阻抗細(xì)胞分析技術(shù)（RTCA）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞活力狀況，M

3、TT法檢測(cè)細(xì)胞毒性。
　　4.取一條新型防御素類雜合肽（5號(hào)肽）處理人結(jié)腸癌細(xì)胞（THC8307），研究其抗腫瘤的作用機(jī)制，采用激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM）觀察與細(xì)胞的親和能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況，蛋白質(zhì)免疫印跡法（WB）檢測(cè)細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)含量變化。
　　結(jié)果：1.設(shè)計(jì)合成了5條新型防御素類雜合肽。
　　2.5條新型防御素類雜合肽的基本性質(zhì)及參數(shù)均符合高效抗菌肽的特性，抗菌肽序列由30多個(gè)

4、氨基酸組成縮減至17或18個(gè)氨基酸，有效降低了抗菌肽的合成成本。
　　3.通過(guò)實(shí)時(shí)阻抗細(xì)胞分析技術(shù)（RTCA）觀測(cè)發(fā)現(xiàn)新型防御素類雜合肽處理腫瘤細(xì)胞后細(xì)胞生長(zhǎng)指數(shù)明顯下降；MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其能有效抑制細(xì)胞增殖水平且呈劑量依賴性。
　　4.熒光染料FITC標(biāo)記的新型防御素類雜合肽處理人結(jié)腸癌細(xì)胞（THC8307）24h，激光掃描共聚焦顯微鏡（CLSM）下觀察顯示雜合肽成功進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)探究新型防御素類雜合肽對(duì)人結(jié)腸

5、癌細(xì)胞的作用機(jī)制，抗菌肽處理組細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞明顯增高，單倍體G0/G1期細(xì)胞百分率明顯下降，而處于S期細(xì)胞百分率相應(yīng)增高(P<0.05)，但抗菌肽+廣譜caspase酶抑制劑處理組細(xì)胞凋亡情況同對(duì)照組差異不明顯(P>0.05)。表明新型防御素類雜合肽抑制細(xì)胞向雙倍體G2/M期分裂期發(fā)展分化，遏制細(xì)胞停留在S期，從而抑制腫瘤細(xì)胞惡性增生；蛋白質(zhì)免疫印跡法（WB）檢測(cè)細(xì)胞蛋白水平，抗菌肽處理組細(xì)胞caspase8、9，Activ

6、e caspase3蛋白含量增加，而Pro capase3,Bcl-2蛋白含量相應(yīng)減少，表明新型防御素類雜合肽主要通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用的。
　　結(jié)論：成功設(shè)計(jì)合成了具有抗腫瘤活性的新型防御素類雜合肽,其抗腫瘤作用研究表明新型防御素類雜合肽有效降低了腫瘤細(xì)胞的活性；進(jìn)一步研究表明新型防御素類雜合肽可以通過(guò)細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用，將有望應(yīng)用于腫瘤疾病的治療，為臨床抗腫瘤藥物研發(fā)提供新的