Eya2在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤中過表達(dá)并通過調(diào)控ERK促進(jìn)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、目的:神經(jīng)膠質(zhì)瘤在全世界范圍內(nèi)都稱得上是常見的惡性腫瘤，并且其每年的發(fā)生率仍然在不斷攀升。在過去的數(shù)十年里，醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)和治療手段在不斷第提高，然后神經(jīng)膠質(zhì)瘤總體不良的預(yù)后情況仍然未得到根本性的改變。在各類型惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的過程中，腫瘤抑制基因和致癌基因保持相對平衡的狀態(tài)非常重要。尋找新的致癌基因?qū)τ诟钊氲亓私馍窠?jīng)膠質(zhì)瘤以及針對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療手段的發(fā)展都具有十分重要的意義。
　　磷酸酶以及transactivator ey

2、es absent(Eya)家族能夠編碼一系列轉(zhuǎn)錄輔酶因子，這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在眼睛的形成過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該蛋白家族依賴EGFR，TGF, Hedghog，Notch等多條分子信號通路在人體器官的形成過程中占據(jù)重要地位。最新研究表明在人類惡性腫瘤細(xì)胞的增殖以及轉(zhuǎn)移過程中該家族蛋白質(zhì)可能扮演重要角色。已經(jīng)有報(bào)道指出在人類卵巢癌細(xì)胞中，Eya2表達(dá)上調(diào)，并且與患者不良預(yù)后情況和較低的生存率有關(guān)聯(lián)。在感染人乳頭狀瘤病毒的宮頸角質(zhì)細(xì)胞中，

3、敲除Eya2基因后細(xì)胞的活力，細(xì)胞的增殖能力以及轉(zhuǎn)移能力都受到不同程度的抑制。已有的這些研究成果提示我們在人類惡性腫瘤細(xì)胞中Eya2可能是一種致癌基因。但是截至目前，Eya2在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的生物學(xué)作用以及表達(dá)模式還未見深入研究。在本次課題研究過程中，我們通過免疫組織化學(xué)方法分析人膠質(zhì)瘤組織中Eya2的臨床意義并探究膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中Eya2的生物學(xué)特性。
　　研究方法:本研究方法經(jīng)過中國醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院相關(guān)機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)通過。90例樣

4、本取自于2012-2014年間在中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院診斷為膠質(zhì)瘤，并接受外科手術(shù)切除的患者。根據(jù)WHO分類原則對膠質(zhì)瘤組織樣本進(jìn)行組織學(xué)分級。
　　采用免疫組織化學(xué)方法對膠質(zhì)瘤組織病理切片進(jìn)行分析，所用試劑盒為Maixin Elivision plus kit。病理切片在檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行脫蠟以及抗原修復(fù)，時(shí)間為2min。然后在室溫條件下用過氧化氫對內(nèi)生性的過氧化物酶進(jìn)行阻斷。接著進(jìn)行一抗孵育，孵育條件為4℃過夜，使用抗體為

5、Eya2兔多克隆抗體。一抗孵育后用PBS緩沖液對病理切片進(jìn)行漂洗，接著孵育第二抗體。染色所用試劑盒為DAB plus kit。病理切片經(jīng)蘇木精進(jìn)行復(fù)染，然后經(jīng)過濃度梯度乙醇脫水，最后封片。
　　細(xì)胞核染色則被認(rèn)定為陽性。樣本核染色小于15％時(shí)可判定為Eya2低表達(dá)，腫瘤樣本核染色大于15％時(shí)可判定為Eya2高表達(dá)。
　　本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞系為膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251，U87，A172，購買單位為美國模式培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。細(xì)

6、胞所用培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并用無菌培養(yǎng)瓶對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染用Eya2質(zhì)粒購買于Origene公司，配套使用的轉(zhuǎn)染試劑為Lipofectamine3000。Eya2干擾所用siRNA以及相對應(yīng)的陰性對照購買于美國Dharmacon公司，配套使用的轉(zhuǎn)染試劑為DharmaFECT。
　　使用PCR儀為7900 Real-Time PCR System，反應(yīng)程序?yàn)?5℃30秒，95℃5秒，60℃30秒，循環(huán)

7、數(shù)為40。反應(yīng)體系為20μl，所用試劑為TAKARA公司所售SYBR Green PCR master mix。PCR實(shí)驗(yàn)所用內(nèi)參為β-actin，基因表達(dá)的相對水平測算方法是參照2-△△Ct法。本實(shí)驗(yàn)過程中所用的引物為Eya2以及β-actin，其引物序列如下:Eya2 forward，5'CACTCCCTGAAGGCACTAAACCTCATC3'，Eya2 reverse,5'CTGCATTATC CTCTCGAAGCAGCTCTC

8、3';Actin forward,5'ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC3'，Actinreverse,5'CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG3'.
　　基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)所用材料為Transwell小室，首先要對小室進(jìn)行包膜處理，每孔用18μl Matrigel，稀釋比例為1∶4。siRNA轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，用胰蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行消化制備細(xì)胞懸液，制備細(xì)胞懸液所用培養(yǎng)基為無血清DMEM培養(yǎng)基，并將該細(xì)胞

9、懸液100μl加入上室。下室加入含有15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。穿過基底膜的細(xì)胞經(jīng)過固定，蘇木精染色后在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
　　集落形成實(shí)驗(yàn):經(jīng)過處理的細(xì)胞接種于直徑為6厘米的培養(yǎng)皿中，連續(xù)培養(yǎng)兩個(gè)星期。用吉姆薩染色液對細(xì)胞集落進(jìn)行染色并于顯微鏡下進(jìn)行觀察，細(xì)胞數(shù)目超過50個(gè)即可記為一個(gè)集落。
　　CCK8實(shí)驗(yàn):將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入20μl CCK8溶液。加入CCK8溶液后要將細(xì)胞繼續(xù)孵育4個(gè)小時(shí)，然后倒

10、掉孔板中的培養(yǎng)基，加入二甲基亞砜溶解的甲瓚溶液，用酶標(biāo)儀測定其吸光度值(450nm)。
　　樣本總蛋白提取所用裂解液為Pierce細(xì)胞裂解緩沖液。蛋白定量參考Bradford方法。SDS-PAGE電泳上樣量為50μg，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)印于PVDF膜上。將該膜孵育一抗，所用抗體為Eya2(1∶1000，Proteintech)，SIX1(1∶1000，Sigma)， cyclin D1, cyclin E,p-ERK and Actin

11、(1∶1000, Cell Signaling Technology, Boston,MA，USA)，孵育條件為4℃過夜。接著進(jìn)行二抗孵育，所用抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔或者鼠IgG(1∶1000，Santa Cruz)，孵育條件為37℃兩小時(shí)。孵育后經(jīng)ECL顯色并在凝膠呈像系統(tǒng)DNR BioImaging System中曝光拍照。最后通過ImageJ軟件進(jìn)行蛋白水平的量化。
　　在500μg目的蛋白中加入足量的抗體，于床上緩慢

12、均勻搖動，4℃過夜。在混合液中加入25μl protein A/G瓊脂糖小球，在搖床上搖動2-3小時(shí)(4℃)，收集免疫復(fù)合物。將所得混合物進(jìn)行低速離心(1500g，5min)，棄上清，用預(yù)冷的PBS緩沖液將沉淀漂洗三次。將沉淀重懸，并在沸水浴中煮沸5min。離心收集上清液并進(jìn)行western blot分析。
　　統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS version16軟件進(jìn)行。對臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)使用卡方檢驗(yàn)法。其他數(shù)據(jù)分析比較使用T檢驗(yàn)法。p＜

13、0.05表示存在顯著差異。
　　結(jié)果:1、通過免疫組織化學(xué)方法檢測90例膠質(zhì)瘤組織樣本，Eya2蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織樣本中的Eya2蛋白表達(dá)量高于正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，比例高達(dá)36.7％(33/90)。分析Eya2表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤臨床病理因素之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Eya2較高的表達(dá)水平與腫瘤分級顯著相關(guān)而與患者的年齡性別無關(guān)。
　　2、通過CCK8細(xì)胞活力分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過Eya2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系A(chǔ)172其細(xì)胞增值率提高，而

14、受到Eya2干擾的細(xì)胞系U251其增殖能力受到抑制。
　　3、集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在A172細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染Eya2后細(xì)胞形成集落的數(shù)目明顯多于轉(zhuǎn)染前，相反，在U251細(xì)胞系中干擾Eya2后細(xì)胞形成集落的數(shù)目則出現(xiàn)較大程度的減少
　　4、基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)在U251細(xì)胞系中敲除了Eya2基因，那么穿過基底膜的U251細(xì)胞數(shù)目明顯減少。相反，在A172細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染Eya2后，能夠穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)目較對照組細(xì)胞明顯增多。

15、r>　　5、流式細(xì)胞術(shù)分析Eya2對細(xì)胞周期的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在轉(zhuǎn)染Eya2的A172細(xì)胞系中，G1-S的轉(zhuǎn)化程度較高，G1期所占百分比降低，S期所占百分比顯著提高。而在Eya2干擾后的U251細(xì)胞系中，S期所占比例大幅下滑。檢測周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)Eya2過表達(dá)能夠顯著上調(diào)周期相關(guān)蛋白cyclin D1以及cyclin E的表達(dá)水平。
　　6、Eya2通過ERK信號通路調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力:Eya2過表達(dá)后上調(diào)了E