基于人防御素5(HD5)高效抗菌肽的設(shè)計、篩選及構(gòu)效關(guān)系研究.pdf

1、人體受輻照后免疫力低下，容易被外源病原菌感染。隨著耐藥現(xiàn)象日趨嚴重[1]，受照者被耐藥細菌感染的風(fēng)險正逐漸提升。由于腸道對輻照非常敏感，且腸腔內(nèi)定殖著大量細菌，輻照常誘發(fā)機體腸源性感染[2]。腸道防御素是存在于哺乳動物體內(nèi)的兩親性天然免疫蛋白，具有抗菌作用強、不易被細菌耐受等特點[34]。人防御素5(HD5，小鼠體內(nèi)對應(yīng)的是隱窩素4)由小腸隱窩Paneth細胞分泌[5]，可調(diào)節(jié)腸道菌群[6-8]，保護機體免受病原菌侵襲[9,10]，在放

2、射性腸源性感染防治方面具有很好的應(yīng)用前景。我們前期圍繞HD5開展了系列研究，探討了放射性腸源性感染時HD5的表達變化及生理意義[2,11]，并通過基因重組表達技術(shù)成功制備出高純度HD5[12]。然而，受鹽離子和負電荷蛋白的屏蔽干擾，HD5在體內(nèi)的抗菌作用受到限制[13]。為此，本研究旨在從構(gòu)效角度優(yōu)化HD5的氨基酸序列，使其能夠在復(fù)雜環(huán)境中依然保持高效抗菌性，提高HD5的生物利用價值。
　　HD5由32個天然氨基酸組成(ATCYC

3、RTGRCARESLSGVCEISGRLYRLCCR);半胱氨酸以Cys1-6/Cys2-4/Cys3-5方式配對形成三對二硫鍵，使HD5呈現(xiàn)β片層樣結(jié)構(gòu)[14]。HD5具有多齒結(jié)合能力，可呈濃度依賴地形成多聚體[15]，放大單體的抗菌效應(yīng)[16]。新近研究發(fā)現(xiàn)，人β防御素1(HBD1)在腸道內(nèi)可被硫氧化還原蛋白(Trx)催化還原成線性多肽，且二硫鍵還原后HBD1的抗菌活性顯著增強[17]。通過體內(nèi)外分子生物學(xué)實驗，我們首先確定了線性H

4、D5在腸腔中的存在，繼而發(fā)現(xiàn)與HB3D1不同，二硫鍵還原減弱了HD5的抗菌活性。HD5的C末端有一個由Arg25-Leu26-Tyr27-Arg28組成的抗菌活性區(qū)域:堿性氨基酸（正電荷）A唱驅(qū)動多肽靜電吸附細菌，疏水性氨基酸Leu和芳香族氨基酸Tyr破壞細菌菌膜[16,18-20]。G1u21是人α防御素中除保守鹽鍵Glu外唯一的酸性氨基酸（負電荷），鄰近HD5的活性區(qū)域[21]。我們將Glu21反電荷替換為Arg，發(fā)現(xiàn)E21R突變可

5、增強HD5的抗菌性，但破壞了多肽的聚合作用。在此基礎(chǔ)上，我們將E21R-HD5的Thr7替換為A唱。T7R突變不僅可以進一步強化E21R-HD5的抗菌活性，還能恢復(fù)單體肽的聚合作用，致使T7E21R-HD5突變肽在高濃度鹽溶液和血清中依然保持高效抗菌性。
　　二硫鍵的正確配對能夠保護HD5免受胰蛋白酶降解，利于多肽在體內(nèi)的穩(wěn)定性閻。由于線性肽容易合成，且在局部組織，如角膜、皮膚、呼吸道等，胰蛋白酶含量極低，應(yīng)用線性抗菌肽治療局部耐

6、藥細菌感染成為新近研究熱點[23-25]。綜合氧化還原和Arg突變對HD5抗菌性的影響，我們設(shè)計出僅含一對二硫鍵、具有高效抗多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDRA.baumannii)活性的突變肽。除了抗菌肽的設(shè)計、篩選，本研究還采用一系列生物化學(xué)方法分析了多肽的結(jié)構(gòu)-效應(yīng)關(guān)系，探討了多肽的抗菌機制。所取得的主要研究結(jié)果與結(jié)論如下:
　　1.聯(lián)合應(yīng)用醋酸尿素-聚丙烯酰氨凝膠電泳(AU-PAGE) Western blot和基質(zhì)輔助激光解吸

7、電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF)首次在人小腸液中檢測到以氧化型和還原型兩種形式存在的HD5;體外實驗證實，腸道硫氧化還原蛋白Trx可催化還原氧化型HD5。
　　2.氧化型HD5二硫鍵還原后抗菌活性減弱;細菌表面電位檢測、生物膜干涉(BLI)、NPN攝取、E.coli ML35內(nèi)膜滲透及流式細胞檢測等實驗發(fā)現(xiàn)還原型HD5靜電吸附細菌、與細菌外膜脂質(zhì)A相互作用、破壞細菌內(nèi)外膜及誘導(dǎo)菌膜去極化的能力均明顯減弱，揭示了氧化型HD5還

8、原后抗菌作用減弱的機制。
　　3.氧化型HD5二硫鍵還原后LPS中和活性增強;圓二色譜(CD)、等溫滴定量熱(ITC)、LBP阻斷、免疫熒光及熒光定量PCR等實驗發(fā)現(xiàn)還原型HD5結(jié)構(gòu)彈性增強，可調(diào)整構(gòu)象結(jié)合LPS，阻斷LPS與下游LPS結(jié)合蛋白(LBP)相互作用，抑制TLR4-NF-κB信號通路的活化，減少炎癥因子的釋放。
　　4.虛擬克隆計數(shù)抗菌實驗發(fā)現(xiàn)將Glu21突變?yōu)锳rg(E21R)能夠增強HD5的抗菌作用;生物膜干

9、涉(BLI)、NPN攝取及E.coli ML35內(nèi)膜滲透實驗檢測到E21R-HD5結(jié)合細菌外膜脂質(zhì)A和脂磷壁酸(LTA)及破壞細菌內(nèi)外膜的能力均明顯增強，闡明了E21R突變增強HD5抗菌性的機制。
　　5.ITC觀察到E21R突變后HD5的自締合能力減弱;利用X-射線單晶衍射，我們解析了E21R-HD5的晶體結(jié)構(gòu)并將其提交至蛋白數(shù)據(jù)庫(PDB)，編號為4RBX;E21R-HD5呈現(xiàn)為典型的單體肽。自締合能力減弱可致使防御素抗菌性下

10、降;E21R突變雖然破壞HD5的自締合，卻增強了多肽的抗菌作用，提示適宜的Arg突變可補償HD5因構(gòu)象缺陷引起的功能不足。
　　6.晶體可視化分析發(fā)現(xiàn)Glu21、Thr7、Ser23及Gly24殘基均鄰近HD5的C末端抗菌活性區(qū)域;將這些位點分別突變?yōu)锳rg(E21R、T7R、S23R、G24R)，虛擬克隆計數(shù)抗菌實驗結(jié)果顯示各突變肽的活性強弱依次是:E21R-HD5＞T7R-HD5＞S23R-HD5≈G24R-HD5。
　

11、　7.虛擬克隆計數(shù)抗菌實驗和ITC發(fā)現(xiàn)T7R突變不僅可以增強E21R-HD5的抗菌作用，還能提高單體肽的自締合能力。利用X-射線單晶衍射，我們解析了T7E21R-HD5的單晶結(jié)構(gòu)并將其提交至PDB，編號為4RBX; T7E21R-HD5呈現(xiàn)為非典型二聚體。該結(jié)果首次證實Arg突變可促進單體肽自締合。
　　8.BLI、NPN攝取及E.coli ML35內(nèi)膜滲透實驗發(fā)現(xiàn)T7E21R-HD5結(jié)合細菌外膜脂質(zhì)A和LTA及破壞細菌內(nèi)外膜的能

12、力均強于E21R-HD5，揭示了T7R突變增強E21R-HD5抗菌活性的機制。
　　9.T7E21R-HD5能夠耐受鹽離子的屏蔽干擾，在高濃度血清中依然保持高效抗菌性。此外，該突變肽溶血性低、可耐受胰蛋白酶降解。
　　10.Ala突變證實去除二硫鍵或僅保留一對二硫鍵均可減弱HD5的抗MDRA.baumannii活性;其中，含Cys2-4二硫鍵的突變肽HM3抗菌作用相對較強。將HM3的非堿性和非疏水性氨基酸突變?yōu)锳rg后，突變

13、肽HM5的抗菌性顯著增強。
　　11.細菌涂布計數(shù)抗菌實驗發(fā)現(xiàn)突變肽HM5呈濃度、時間依賴地殺傷MDRA.baumannii并在生理濃度鹽溶液中依然保持高效抗菌性;BLI、NPN攝取及細胞流式檢測到突變肽結(jié)合細菌外膜脂質(zhì)A、破壞細菌外膜及誘導(dǎo)菌膜去極化的能力均顯著增強，闡明了HM5的抗菌機制。
　　12.利用基因重組表達技術(shù)，我們制備了高純度的A.baumannii外膜蛋白A(OMPA)。A.baumannii OMPA具有