雙靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗的制備及其對(duì)損傷脊髓的免疫治療作用.pdf

1、脊髓損傷（SCI）是發(fā)生在脊髓椎管神經(jīng)元?jiǎng)×业貏?chuàng)傷性損傷導(dǎo)致暫時(shí)或永久性的知覺及運(yùn)動(dòng)功能缺損。成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）受損后其軸突生長受到抑制而影響其神經(jīng)再生及功能的自我修復(fù)，而外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)纖維受損后卻能進(jìn)行自我修復(fù)并恢復(fù)其功能。影響CNS損傷修復(fù)和再生的因素很多，一方面是因?yàn)樯窠?jīng)纖維生長能力受限、膠質(zhì)瘢痕的形成及神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏等多種因素致使損傷軸突再生困難；另一方面是由于損傷的中樞微環(huán)境中髓磷脂相關(guān)抑制因子(MAIs)

2、及其受體的大量存在，進(jìn)而介導(dǎo)髓磷脂抑制信號(hào)的傳遞。因此，通過直接干預(yù)MAIs抑制信號(hào)的傳遞促進(jìn)神經(jīng)再生，可能作為針對(duì)脊髓損傷行之有效的治療方法之一。作為MAIs的共同受體，Nogo受體（Nogo-66 receptor，NgR）和成對(duì)免疫球蛋白樣受體B（paired immunoglobulin-like receptor B，PirB）能介導(dǎo)MAIs抑制信號(hào)的傳遞，因此，抑制 NgR和 PirB可能會(huì)促進(jìn)神經(jīng)軸突再生和保護(hù)神經(jīng)元生長錐

3、完整，進(jìn)而發(fā)揮神經(jīng)再生的促進(jìn)效應(yīng)。核酸疫苗作為一種新的免疫治療策略近年來已被廣泛應(yīng)用于各種疾病的治療研究，而人 GM-CSF具有增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答和促進(jìn) T細(xì)胞增殖的能力，是一種重要細(xì)胞因子佐劑，同時(shí)，GM-CSF還具有神經(jīng)保護(hù)作用，可激活神經(jīng)干、祖細(xì)胞且抑制膠質(zhì)瘢痕的形成。為探討GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗對(duì)損傷脊髓的免疫治療作用，本研究采用基因工程方法分別克隆NgR、PirB和 GM-CSF基因片段，構(gòu)建pcDNA-GMCSF

4、-NgR-PirB真核表達(dá)載體，然后與脂質(zhì)體一起形成復(fù)合核酸疫苗。免疫大鼠后通過免疫學(xué)、行為學(xué)及組織學(xué)等方法探討 GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗對(duì)損傷脊髓的修復(fù)作用及運(yùn)動(dòng)功能的改善情況，為中樞神經(jīng)軸突再生的免疫治療提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴PCR擴(kuò)增共表達(dá)GM-CSF、NgR及 PirB目的基因片段，分別亞克隆至pcDNA3.1(+)質(zhì)粒中，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體 pcDNA-GMCSF-NgR-Pi

5、rB，并進(jìn)行PCR、酶切及基因測(cè)序鑒定。重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體法體外轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞并用免疫熒光法檢測(cè)NgR和PirB蛋白的體外表達(dá)情況。⑵將脂質(zhì)體與GMCSF-NgR-PirB重組質(zhì)粒以1:1的體積比混合后形成核酸疫苗，以SD大鼠為研究對(duì)象，肌肉注射連續(xù)免疫6w，期間每周檢測(cè)免疫血清中抗體的效價(jià)。同時(shí)觀察動(dòng)物體重及行為學(xué)改變情況，評(píng)價(jià)疫苗免疫能否引起大鼠變態(tài)性腦脊髓炎。⑶核酸疫苗連續(xù)免疫6w后，制備脊髓左側(cè)半橫切損傷動(dòng)物模型，并分別從行為學(xué)

6、、組織學(xué)及分子水平評(píng)價(jià) GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗對(duì)軸突再生及運(yùn)動(dòng)功能改善的促進(jìn)作用。
　　本研究表明：①成功構(gòu)建了GMCSF、NgR和PirB共表達(dá)的真核表達(dá)載體。②制備了雙靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗及SD大鼠左側(cè)半橫切脊髓損傷動(dòng)物模型。③雙靶向GMCSF-NgR-PirB核酸疫苗能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體，中和內(nèi)源性NgR及PirB，有效逆轉(zhuǎn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)NgR和PirB介導(dǎo)的髓磷脂再生抑制信號(hào)的傳