LINGO-1多克隆抗體的制備及其被動免疫治療大鼠急性脊髓損傷的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后神經(jīng)組織自我修復功能極其有限,其最主要的因為是由于崩解的脊髓組織釋放出大量的軸突生長抑制因子,形成不利于軸突再生的微環(huán)境。目前研究表明,許多軸突生長抑制因子都是通過與神經(jīng)元細胞膜表面的NgR受體復合體(NgR/p75/LINGO-1及NgR/TAJ(TROY)/LINGO-1)結(jié)合后,激活胞內(nèi)RhoA信號,從而導致生長錐潰變及軸突再生失敗。LINGO-1

2、(LRR and Ig domain-containing,Nogo Receptor-interacting protein,LINGO-1)是構(gòu)成NgR受體復合體的重要組成部分,同時,其亦存在于少突膠質(zhì)細胞,在分化、損傷后細胞存活及再髓鞘化等過程中起著負性調(diào)節(jié)的作用。因此,LINGO-1可作為對抗軸突生長抑制因子抑制作用并促進再生軸突髓鞘化的藥物靶點。
　　 一些研究者給予SCI動物主動免疫軸突生長抑制因子產(chǎn)生相應的中和性抗

3、體后,均能達到阻斷抑制因子、改善損傷灶局部微環(huán)境、促進神經(jīng)再生和功能恢復的目的。但即使損傷后立即給予主動免疫治療也至少需要4～6w的時間才能產(chǎn)生保護性抗體。因此,探索早期被動免疫手段促進SCI后功能恢復更適應臨床實際需要。
　　 我們的設想是在脊髓損傷后早期,應用LINGO-1特異性抗體阻斷損傷處該分子的生物學作用,應當可以削弱下游的軸突抑制信號,阻止損傷局部的神經(jīng)元凋亡,達到促進軸突再生及神經(jīng)功能恢復的目的?？贵w選擇的方面,單

4、克隆抗體有著高度的特異性和優(yōu)越的質(zhì)量控制,是抗體治療的首選,但是其制備周期長、技術要求較高,因此成本相對高昂。而必需明確的首要問題是,阻斷靶分子是否能收獲有益的治療效果。因此,基于有效性和經(jīng)濟性的考慮,本研究采用經(jīng)典的多克隆抗體制備方法獲取的足量、高滴度的抗血清作為后續(xù)動物實驗的干預手段。
　　 本課題通過實驗研究初步觀察了LINGO-1多克隆抗體對脊髓半橫斷大鼠模型的早期干預作用,為促進SCI后功能修復提供新的思路。研究內(nèi)容主

5、要分為以下三個部分:(1)LINGO-1抗血清的制備及鑒定；(2)LINGO-1抗血清對脊髓半橫斷大鼠模型干預的可行性分析；(3)觀察LINGO-1抗血清對脊髓半橫斷大鼠模型的神經(jīng)再生及功能恢復的影響。
　　 第一部分:LINGO-1多克隆抗體的制備及鑒定
　　 目的：
　　 表達和純化帶多聚組氨酸(6×His)標簽的人LINGO-1胞外段(hLINGO-1aa76-319)融合蛋白,并制備兔源性抗hLINGO-

6、1aa76-319的多克隆抗體。
　　 方法:
　　 1.PCR擴增LINGO-1的76-319位氨基酸編碼序列cDNA:根據(jù)hLINGO-1aa76-319的cDNA序列設計特異引物,上下游引物的5’端分別引入BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切位點及保護堿基,以pCMV-SPORT6-LINGO-1質(zhì)粒為模板,高保真Taq酶作用下PCR擴增hLINGO-1aa76-319cDNA片段。
　　 2.pET30a(+)

7、-hLINGO-1aa76-319原核表達載體的構(gòu)建:hLINGO-1aa76-319 cDNA的PCR產(chǎn)物及pET30a(+)載體分別用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ雙酶切后回收后進行體外連接,轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細菌,挑取單克隆菌落,搖菌,提取質(zhì)粒。pET30a(+)-hLINGO-1aa76-319重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及酶切鑒定后,行核苷酸序列測定和分析。
　　 3.hLINGO-1aa76-319融合蛋白誘導表達條件的優(yōu)化:將pE

8、T30a(+)-hLINGO-1aa76-319重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細菌,挑取菌落PCR陽性的單菌落接種于卡那抗性的LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD為0.6～0.8時分別加入不同終濃度的IPTG誘導,在不同時間點分別收集樣本行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍染色顯示蛋白條帶,分析確定最佳誘導表達條件。取最高蛋白表達量的菌液適量離心,沉淀重懸于裂菌緩沖液,冰浴超聲裂解,分別取上清、沉淀行SDS-PAGE電泳及Western blot檢測,

9、以明確目的蛋白在宿主菌中的表達形式并驗證融合蛋白是否正確表達。
　　 4.hLINGO-1aa76-319融合蛋白大量表達后的純化:優(yōu)化表達條件下,大量培養(yǎng)1000mL菌液,離心后收集菌體沉淀,裂解緩沖液重懸細菌,冰浴后超聲破碎,離心獲取包涵體,脲溶解后經(jīng)Ni-NTA螯合樹脂層析洗脫回收LINGO-1蛋白。BCA法測定蛋白濃度,SDS-PAGE電泳結(jié)果經(jīng)Bandscan5.0圖像分析軟件計算蛋白純度。為了獲得純度更高的蛋白,將全

10、部蛋白初樣經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后,切取目的蛋白膠塊-80℃凍存。
　　 5.抗hLINGO-1aa76-319多克隆抗體的制備:凍存過夜的蛋白膠塊加適量弗氏佐劑研磨。充分乳化后,家兔背部多點皮下注射。每隔7d進行一次加強免疫,第3次免疫注射后的第10d微量取血,4℃冰箱過夜,離心獲得血清。以免疫前兔血清作為陰性對照,ELISA測定血清效價。當抗體效價達到預期水平時即可放血收獲抗血清,-80℃冰箱保存。
　　 6.抗

11、血清特異性鑒定及效價驗證:表達hLINGO-1aa76-319融合蛋白的BL21菌體總蛋白及提取的大鼠腦組織膜蛋白進行SDS-PAGE電泳,制備的LINGO-1多克隆抗體為一抗,Western blot方法驗證抗體的特異性。用純化后hLINGO-1aa76-319融合蛋白包被ELISA反應孔,以免疫前兔血清作為陰性對照,ELISA法檢測LINGO-1抗血清的效價。
　　 結(jié)論:
　　 制備的抗LINGO-1多克隆抗體具備

12、良好的特異性和較高的抗體效價,為進一步研究LINGO-1蛋白的生物學功能奠定了重要的實驗基礎。
　　 第二部分:LINGO-1多克隆抗體的組織滲透性及其與抗原特異性結(jié)合能力分析
　　 目的：
　　 探討脊髓損傷處局部給予的LINGO-1多克隆抗體的組織滲透性及與抗原的特異性結(jié)合能力,為后續(xù)的被動免疫治療研究提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 將12只成年雌性SD大鼠隨機分為正常組、對照組(半橫斷對照血

13、清組)和實驗組(半橫斷抗血清組)。正常組大鼠不做任何處理,另外兩組均行T9脊髓背側(cè)半橫斷術。半橫斷術后,使用微量滲透泵分別給予對照血清和LINGO-1抗血清。術后3d和28d取各組T8～T10節(jié)段脊髓作冰凍切片,應用間接和直接組織免疫熒光染色法,以兩獨立樣本的t檢驗進行統(tǒng)計學分析,探討LINGO-1多抗可否進入脊髓組織并是否與LINGO-1分子(抗原)特異性結(jié)合。
　　 結(jié)論:
　　 成功建立脊髓背側(cè)半橫斷模型,局部應用

14、抗血清后能有效滲透到損傷的脊髓組織中,并能與脊髓組織中的抗原特異性結(jié)合；此外,在脊髓損傷區(qū)傷后3～28天的時間窗內(nèi)均可檢測到LINGO-1多克隆抗體,證實該多抗可在損傷局部較長的時間內(nèi)發(fā)揮被動免疫的作用。
　　 第三部分:LINGO-1多克隆抗體對脊髓半橫斷模型大鼠的被動免疫治療效果評估
　　 目的：
　　 評價脊髓損傷處局部給予LINGO-1多克隆抗體的治療效果。
　　 方法:
　　 將49只成

15、年雌性SD大鼠分為正常組(3只)、半橫斷對照血清組(23只)及半橫斷抗血清組(23只)。正常組大鼠不做任何處理,另外兩組均行T9脊髓半橫斷術。術后,兩組使用微量滲透泵鞘內(nèi)分別局部給予對照血清和LINGO-1抗血清。術后3d,利用蛋白pull-down技術及Western blot檢測方法對各組脊髓損傷處組織行RhoA活性分析,組織免疫熒光雙標法檢測各組神經(jīng)元凋亡情況。術后14d,立體定向注射BDA于右側(cè)的感覺運動皮層順行示蹤CST纖維。

16、術后28d,處死動物,收集脊髓損傷處橫切和縱切,行BDA免疫組織化學染色。術后1d及每周,對各組動物盲法行BBB行為學評分?；罨疪hoA蛋白量采用單因素ANOVA檢驗及LSD多重比較,凋亡神經(jīng)元計數(shù)采用獨立樣本t檢驗,最大再生軸突長度采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗,BBB行為學評分采用重復測量ANOVA及獨立樣本t檢驗,P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)論:
　　 SCI后鞘內(nèi)給予LINGO-1多克隆抗血清,可有效的阻