LINGO-1多克隆抗體的制備及其被動(dòng)免疫治療大鼠急性脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　 脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)后神經(jīng)組織自我修復(fù)功能極其有限,其最主要的因?yàn)槭怯捎诒澜獾募顾杞M織釋放出大量的軸突生長(zhǎng)抑制因子,形成不利于軸突再生的微環(huán)境。目前研究表明,許多軸突生長(zhǎng)抑制因子都是通過(guò)與神經(jīng)元細(xì)胞膜表面的NgR受體復(fù)合體(NgR/p75/LINGO-1及NgR/TAJ(TROY)/LINGO-1)結(jié)合后,激活胞內(nèi)RhoA信號(hào),從而導(dǎo)致生長(zhǎng)錐潰變及軸突再生失敗。LINGO-1

2、(LRR and Ig domain-containing,Nogo Receptor-interacting protein,LINGO-1)是構(gòu)成NgR受體復(fù)合體的重要組成部分,同時(shí),其亦存在于少突膠質(zhì)細(xì)胞,在分化、損傷后細(xì)胞存活及再髓鞘化等過(guò)程中起著負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。因此,LINGO-1可作為對(duì)抗軸突生長(zhǎng)抑制因子抑制作用并促進(jìn)再生軸突髓鞘化的藥物靶點(diǎn)。
　　 一些研究者給予SCI動(dòng)物主動(dòng)免疫軸突生長(zhǎng)抑制因子產(chǎn)生相應(yīng)的中和性抗

3、體后,均能達(dá)到阻斷抑制因子、改善損傷灶局部微環(huán)境、促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的目的。但即使損傷后立即給予主動(dòng)免疫治療也至少需要4～6w的時(shí)間才能產(chǎn)生保護(hù)性抗體。因此,探索早期被動(dòng)免疫手段促進(jìn)SCI后功能恢復(fù)更適應(yīng)臨床實(shí)際需要。
　　 我們的設(shè)想是在脊髓損傷后早期,應(yīng)用LINGO-1特異性抗體阻斷損傷處該分子的生物學(xué)作用,應(yīng)當(dāng)可以削弱下游的軸突抑制信號(hào),阻止損傷局部的神經(jīng)元凋亡,達(dá)到促進(jìn)軸突再生及神經(jīng)功能恢復(fù)的目的?？贵w選擇的方面,單

4、克隆抗體有著高度的特異性和優(yōu)越的質(zhì)量控制,是抗體治療的首選,但是其制備周期長(zhǎng)、技術(shù)要求較高,因此成本相對(duì)高昂。而必需明確的首要問(wèn)題是,阻斷靶分子是否能收獲有益的治療效果。因此,基于有效性和經(jīng)濟(jì)性的考慮,本研究采用經(jīng)典的多克隆抗體制備方法獲取的足量、高滴度的抗血清作為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的干預(yù)手段。
　　 本課題通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究初步觀察了LINGO-1多克隆抗體對(duì)脊髓半橫斷大鼠模型的早期干預(yù)作用,為促進(jìn)SCI后功能修復(fù)提供新的思路。研究?jī)?nèi)容主

5、要分為以下三個(gè)部分:(1)LINGO-1抗血清的制備及鑒定；(2)LINGO-1抗血清對(duì)脊髓半橫斷大鼠模型干預(yù)的可行性分析；(3)觀察LINGO-1抗血清對(duì)脊髓半橫斷大鼠模型的神經(jīng)再生及功能恢復(fù)的影響。
　　 第一部分:LINGO-1多克隆抗體的制備及鑒定
　　 目的：
　　 表達(dá)和純化帶多聚組氨酸(6×His)標(biāo)簽的人LINGO-1胞外段(hLINGO-1aa76-319)融合蛋白,并制備兔源性抗hLINGO-

6、1aa76-319的多克隆抗體。
　　 方法:
　　 1.PCR擴(kuò)增LINGO-1的76-319位氨基酸編碼序列cDNA:根據(jù)hLINGO-1aa76-319的cDNA序列設(shè)計(jì)特異引物,上下游引物的5’端分別引入BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基,以pCMV-SPORT6-LINGO-1質(zhì)粒為模板,高保真Taq酶作用下PCR擴(kuò)增hLINGO-1aa76-319cDNA片段。
　　 2.pET30a(+)

7、-hLINGO-1aa76-319原核表達(dá)載體的構(gòu)建:hLINGO-1aa76-319 cDNA的PCR產(chǎn)物及pET30a(+)載體分別用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ雙酶切后回收后進(jìn)行體外連接,轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)菌,挑取單克隆菌落,搖菌,提取質(zhì)粒。pET30a(+)-hLINGO-1aa76-319重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及酶切鑒定后,行核苷酸序列測(cè)定和分析。
　　 3.hLINGO-1aa76-319融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化:將pE

8、T30a(+)-hLINGO-1aa76-319重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)菌,挑取菌落PCR陽(yáng)性的單菌落接種于卡那抗性的LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD為0.6～0.8時(shí)分別加入不同終濃度的IPTG誘導(dǎo),在不同時(shí)間點(diǎn)分別收集樣本行SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色顯示蛋白條帶,分析確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。取最高蛋白表達(dá)量的菌液適量離心,沉淀重懸于裂菌緩沖液,冰浴超聲裂解,分別取上清、沉淀行SDS-PAGE電泳及Western blot檢測(cè),

9、以明確目的蛋白在宿主菌中的表達(dá)形式并驗(yàn)證融合蛋白是否正確表達(dá)。
　　 4.hLINGO-1aa76-319融合蛋白大量表達(dá)后的純化:優(yōu)化表達(dá)條件下,大量培養(yǎng)1000mL菌液,離心后收集菌體沉淀,裂解緩沖液重懸細(xì)菌,冰浴后超聲破碎,離心獲取包涵體,脲溶解后經(jīng)Ni-NTA螯合樹脂層析洗脫回收LINGO-1蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度,SDS-PAGE電泳結(jié)果經(jīng)Bandscan5.0圖像分析軟件計(jì)算蛋白純度。為了獲得純度更高的蛋白,將全

10、部蛋白初樣經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后,切取目的蛋白膠塊-80℃凍存。
　　 5.抗hLINGO-1aa76-319多克隆抗體的制備:凍存過(guò)夜的蛋白膠塊加適量弗氏佐劑研磨。充分乳化后,家兔背部多點(diǎn)皮下注射。每隔7d進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫,第3次免疫注射后的第10d微量取血,4℃冰箱過(guò)夜,離心獲得血清。以免疫前兔血清作為陰性對(duì)照,ELISA測(cè)定血清效價(jià)。當(dāng)抗體效價(jià)達(dá)到預(yù)期水平時(shí)即可放血收獲抗血清,-80℃冰箱保存。
　　 6.抗

11、血清特異性鑒定及效價(jià)驗(yàn)證:表達(dá)hLINGO-1aa76-319融合蛋白的BL21菌體總蛋白及提取的大鼠腦組織膜蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,制備的LINGO-1多克隆抗體為一抗,Western blot方法驗(yàn)證抗體的特異性。用純化后hLINGO-1aa76-319融合蛋白包被ELISA反應(yīng)孔,以免疫前兔血清作為陰性對(duì)照,ELISA法檢測(cè)LINGO-1抗血清的效價(jià)。
　　 結(jié)論:
　　 制備的抗LINGO-1多克隆抗體具備

12、良好的特異性和較高的抗體效價(jià),為進(jìn)一步研究LINGO-1蛋白的生物學(xué)功能奠定了重要的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 第二部分:LINGO-1多克隆抗體的組織滲透性及其與抗原特異性結(jié)合能力分析
　　 目的：
　　 探討脊髓損傷處局部給予的LINGO-1多克隆抗體的組織滲透性及與抗原的特異性結(jié)合能力,為后續(xù)的被動(dòng)免疫治療研究提供依據(jù)。
　　 方法:
　　 將12只成年雌性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、對(duì)照組(半橫斷對(duì)照血

13、清組)和實(shí)驗(yàn)組(半橫斷抗血清組)。正常組大鼠不做任何處理,另外兩組均行T9脊髓背側(cè)半橫斷術(shù)。半橫斷術(shù)后,使用微量滲透泵分別給予對(duì)照血清和LINGO-1抗血清。術(shù)后3d和28d取各組T8～T10節(jié)段脊髓作冰凍切片,應(yīng)用間接和直接組織免疫熒光染色法,以兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,探討LINGO-1多抗可否進(jìn)入脊髓組織并是否與LINGO-1分子(抗原)特異性結(jié)合。
　　 結(jié)論:
　　 成功建立脊髓背側(cè)半橫斷模型,局部應(yīng)用

14、抗血清后能有效滲透到損傷的脊髓組織中,并能與脊髓組織中的抗原特異性結(jié)合；此外,在脊髓損傷區(qū)傷后3～28天的時(shí)間窗內(nèi)均可檢測(cè)到LINGO-1多克隆抗體,證實(shí)該多抗可在損傷局部較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)發(fā)揮被動(dòng)免疫的作用。
　　 第三部分:LINGO-1多克隆抗體對(duì)脊髓半橫斷模型大鼠的被動(dòng)免疫治療效果評(píng)估
　　 目的：
　　 評(píng)價(jià)脊髓損傷處局部給予LINGO-1多克隆抗體的治療效果。
　　 方法:
　　 將49只成

15、年雌性SD大鼠分為正常組(3只)、半橫斷對(duì)照血清組(23只)及半橫斷抗血清組(23只)。正常組大鼠不做任何處理,另外兩組均行T9脊髓半橫斷術(shù)。術(shù)后,兩組使用微量滲透泵鞘內(nèi)分別局部給予對(duì)照血清和LINGO-1抗血清。術(shù)后3d,利用蛋白pull-down技術(shù)及Western blot檢測(cè)方法對(duì)各組脊髓損傷處組織行RhoA活性分析,組織免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)各組神經(jīng)元凋亡情況。術(shù)后14d,立體定向注射BDA于右側(cè)的感覺運(yùn)動(dòng)皮層順行示蹤C(jī)ST纖維。

16、術(shù)后28d,處死動(dòng)物,收集脊髓損傷處橫切和縱切,行BDA免疫組織化學(xué)染色。術(shù)后1d及每周,對(duì)各組動(dòng)物盲法行BBB行為學(xué)評(píng)分?；罨疪hoA蛋白量采用單因素ANOVA檢驗(yàn)及LSD多重比較,凋亡神經(jīng)元計(jì)數(shù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),最大再生軸突長(zhǎng)度采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn),BBB行為學(xué)評(píng)分采用重復(fù)測(cè)量ANOVA及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 SCI后鞘內(nèi)給予LINGO-1多克隆抗血清,可有效的阻