不同溫度、碳源和氮源對(duì)六種海洋微藻中多不飽和脂肪酸的影響及綠色巴夫藻16SrRNA基因的克隆與序列分析.pdf

1、[目的]
　　 本課題期望通過(guò)分析觀察不同培養(yǎng)溫度、碳源和氮源對(duì)綠色巴夫藻(Pavlovaviridis)，湛江等鞭金藻(Dicrateria inornata)，微綠球藻(Nannochloropsis culata)，小球藻(Chlorella vulgaris)，小環(huán)藻(Cyclotella caspia)，海鏈藻(Thalassiosira)等六種富含二十二碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的海洋微藻中多不飽和

2、脂肪酸組成的影響，篩選出有利于這六種海洋微藻中EPA、DHA生物合成的優(yōu)化培養(yǎng)條件。此外，通過(guò)對(duì)綠色巴夫藻的16S rRNA基因的克隆和測(cè)序，并與巴夫藻屬其它藻種的16S rRNA基因進(jìn)行同源性比對(duì)，構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)，從而分析巴夫藻屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。
　　 [方法]
　　 1.六種海洋微藻的培養(yǎng)
　　 溫度實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)液采用湛水107-18號(hào)配方(見(jiàn)表1)，藻種按1:10接種量至300mL的錐形瓶中，14:10(光照

3、/黑暗)恒定光照培養(yǎng)，設(shè)置10℃，15℃，20℃，25℃四種不同培養(yǎng)溫度來(lái)分別培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)選用的六種藻種。
　　 碳源實(shí)驗(yàn)：去掉湛水107-18號(hào)配方中的碳源，分別加入本實(shí)驗(yàn)考察的葡萄糖，半乳糖，蔗糖作為碳源，溫度采用上述實(shí)驗(yàn)中所得到的各種藻類的最佳培養(yǎng)溫度，其它操作同溫度實(shí)驗(yàn)。
　　 氮源實(shí)驗(yàn)：去掉湛水107-18號(hào)配方中的氮源，分別加入本實(shí)驗(yàn)考察的胰蛋白棟，酵母膏，氯化銨作為氮源，溫度采用上述實(shí)驗(yàn)中所得到的各種藻類的最

4、佳培養(yǎng)溫度，其它操作同溫度實(shí)驗(yàn)。
　　 2.基于GenBank中已知微藻的16S rRNA基因序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR的方法從六種海洋微藻中克隆16S rRNA基因的片段序列。
　　 3.基于綠色巴夫藻的16S rRNA基因及提交到GenBank中的巴夫藻屬其他藻種的16S rRNA基因構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。
　　 [結(jié)果]
　　 1.溫度實(shí)驗(yàn)：在10℃，15℃，20℃，25℃四種不同溫度下，本實(shí)驗(yàn)選取的六種

5、藻種均能較好的生長(zhǎng)。在10～20℃之間，綠色巴夫藻的EPA含量隨著溫度的升高而增加，在20℃時(shí)EPA含量達(dá)到最大值，占總脂的25.93％；DHA含量隨溫度變化不大。在10～25℃整個(gè)實(shí)驗(yàn)溫度觀察范圍，湛江等鞭金藻的DHA含量隨著溫度的增加而逐漸減少，在10℃條件下有最大值，占總脂含量的17.11％；EPA含量隨溫度變化不大。
　　 2.碳源實(shí)驗(yàn)：在以葡萄糖，D(+)半乳糖，蔗糖作為碳源，最佳培養(yǎng)溫度的條件下，綠色巴夫藻和湛江等鞭

6、金藻均能較好的生長(zhǎng)。綠色巴夫藻在以葡萄糖為碳源的條件下培養(yǎng)，C18:3(ω-3)含量達(dá)到占總脂的56.11％的最大值，而EPA含量變化不大。湛江等鞭金藻在以葡萄糖作為碳源的條件下培養(yǎng)，DHA含量達(dá)到占總脂的14.01％的最大值；同時(shí)，在三種不同碳源的條件下培養(yǎng)，其EPA含量變化不大。
　　 3.氮源實(shí)驗(yàn)：在最佳培養(yǎng)溫度條件下，分別以胰蛋白棟，酵母膏，氯化銨作為氮源，綠色巴夫藻和湛江等鞭金藻均能較好的生長(zhǎng)。綠色巴夫藻在以酵母膏為氮

7、源的條件下培養(yǎng)時(shí)，其C18:3(ω-3)含量達(dá)到占總脂的51.14％的最大值，而EPA含量變化不大。湛江等鞭金藻在以胰蛋白棟作為氮源的條件下培養(yǎng)時(shí)，其DHA含量達(dá)到占總脂的15.9％的最大值，而分別在三種不氮源的條件下培養(yǎng)，其EPA含量變化不大。
　　 4.克隆得到了綠色巴夫藻的16S rRNA基因部分序列，與巴夫藻屬其他藻種的16S rRNA基因具有較高的同源性?；?6S rRNA基因的巴夫藻屬構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)顯示綠色巴夫藻與其

8、他的巴夫藻屬藻種的遺傳距離在0.008～0.048之間。
　　 [結(jié)論]
　　 1.在培養(yǎng)液采用湛水107-18號(hào)配方，溫度為20℃的培養(yǎng)條件下，綠色巴夫藻的EPA達(dá)到最大值，占總脂的25.93％。同時(shí)湛江等鞭金藻的DHA的含量在溫度10℃的培養(yǎng)條件下達(dá)到最大值，占總脂的17.11％。
　　 2.在以葡萄糖作為碳源的培養(yǎng)條件下，綠色巴夫藻的C18:3(ω-3)含量達(dá)到最大值，占總脂的56.11％。在以葡萄糖作為碳

9、源的培養(yǎng)條件下，湛江等鞭金藻DHA含量達(dá)到最大值，占總脂的14.01％。
　　 3.在以酵母膏作為氮源的培養(yǎng)條件下，綠色巴夫藻的C18:3(ω-3)含量達(dá)到最大值，占總脂的51.14％。在以胰蛋白棟作為氮源的培養(yǎng)條件下，湛江等鞭金藻DHA含量達(dá)到最大值，占總脂的15.9％。
　　 4.克隆測(cè)序得到了綠色巴夫藻的16S rRNA基因部分序列與巴夫藻屬其他藻種的16S rRNA基因具有較高的同源性，遺傳距離在0.008～0.