Let-7c和APRIL在非小細胞肺癌(NSCLC)發(fā)生發(fā)展中的作用及其初步分子機制研究.pdf

1、目前在中國，肺癌導(dǎo)致的死亡率已高居腫瘤病死率的首位。肺癌在組織學(xué)上分為小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小細胞肺癌(non-small celllung cancer, NSCLC)兩大類，其中NSCLC導(dǎo)致的死亡率遠高于小細胞肺癌，約占80％。近年來，雖然NSCLC的診斷及治療技術(shù)取得了巨大進展，但其5年生存率仍較低（約15％左右）。
　　MicroRNAs是一類廣泛存在于動植物體內(nèi)高度保

2、守的非編碼單鏈RNA，只有18-25個核苷酸長度。MicroRNAs主要通過影響信使RNA(mRNA)的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)基因的翻譯和表達，發(fā)揮其調(diào)控作用。MicroRNAs調(diào)節(jié)mRNA的轉(zhuǎn)錄作用主要表現(xiàn)為:1.通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默;2.通過抑制靶向mRNA翻譯或分裂過程。近10余年來許多研究表明microRNA在腫瘤生長、增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用;同時microRNA在組織、血漿、糞便及其它體液中表達穩(wěn)定，即使是小樣本量標(biāo)本也能進行定量檢測，

3、這說明microRNA可以作為腫瘤診斷和判斷預(yù)后的潛在生物學(xué)標(biāo)記物。Let-7是在秀麗隱桿線蟲研究中被發(fā)現(xiàn)的，是繼lin-4之后被確立的第二個microRNA。目前Let-7有13種家族成員已明確基因序列。有研究證實在多種腫瘤（前列腺癌、卵巢癌、肺癌等）的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后中，Let-7呈現(xiàn)低表達，而且恢復(fù)其表達后可靶向作用于多種癌基因（Ras、C-myc和HMGA2等），起到抑制腫瘤生長的作用。Let-7c是Let-7家族成員之一，位于

4、21q11.21。多項研究認為Let-7c是一類腫瘤抑制因子，在多種人類腫瘤中表達水平下調(diào)或缺失，但關(guān)于Let-7c在NSCLC中的作用機制探討還缺乏大樣本高通量的研究。
　　本研究的主要目的是通過研究miR-Let-7c、APRIL在NSCLC腫瘤、癌旁組織及外周血中的表達情況，同時比較miR-Let-7c、APRIL及其相應(yīng)受體BCMA和TACI表達情況與NSCLC患者臨床病例特征之間的關(guān)系，通過體外實驗檢測APRIL及其相應(yīng)

5、受體BCMA和TACI對肺癌細胞系增殖、遷移及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，以期探尋miR-Let-7c、APRIL在NSCLC中的作用機制，并為這兩者是否可作為NSCLC診斷或預(yù)后判斷生物學(xué)標(biāo)志物提供理論基礎(chǔ)。
　　第一部分:Let-7c降低在非小細胞肺癌(NSCLC)患者中的臨床意義及其診斷價值研究
　　方法:
　　(1)采用病例對照研究，收集76名手術(shù)切除的NSCLC患者癌及癌旁組織，手術(shù)前后血漿樣本和180名健康對照血漿

6、樣本。
　　(2)采用qRT-PCR方法，檢測Let-7c mRNA在NSCLC組織、癌旁組織及外周血的表達水平。
　　(3)采用qRT-PCR方法，檢測Let-7c mRNA在NSCLC患者手術(shù)前后及健康對照血漿中的表達水平。
　　(4)檢測A549和H1650細胞中l(wèi)et-7c表達水平，轉(zhuǎn)染let-7c mimics以恢復(fù)A549和H1650細胞let-7c的表達。MTS、細胞劃痕和CCK8實驗評價let-7c對N

7、SCLC細胞增殖和細胞周期的影響。
　　(5)統(tǒng)計學(xué)處理:所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進行統(tǒng)計處理，每組實驗重復(fù)三次，取(x)±SD進行計算處理。P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　(1)76例NSCLC患者癌組織較癌旁組織miR-Let-7c的表達顯著下降(P＜0.05)。
　　(2)組織標(biāo)本中miR-Let-7c的表達，與NSCLC患者的病理分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且有統(tǒng)計學(xué)意義(

8、P＜0.05)。
　　(3)與健康對照組相比，NSCLC組血漿miR-Let-7c表達明顯下調(diào)(P＜0.05)。
　　(4)NSCLC患者血漿中miR-Let-7c表達與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及分化程度有顯著相關(guān)性。
　　(5)miR-Let-7c的診斷敏感度和特異性分別為72％和78％，血漿中miR-Let-7c在NSCLC的診斷準(zhǔn)確率ROC曲線分析顯示，AUC面積為0.714。
　　(6)NSCLC患者手術(shù)前血漿mi

9、R-Let-7c表達水平較術(shù)后顯著下降。
　　(7)A549和H1650細胞中l(wèi)et-7c呈低表達，轉(zhuǎn)染恢復(fù)A549和H1650細胞中l(wèi)et-7c的表達后，細胞的增殖受到抑制。
　　第二部分:非小細胞肺癌(NSCLC)患者中APRIL、BCMA和TACI臨床意義及其可能分子機制探討
　　方法:
　　(1)采用免疫組織化學(xué)方法檢測76例NSCLC患者癌組織及癌旁組織中APRIL及其相關(guān)受體TACI和BCMA蛋白的表

10、達。
　　(2)將BCMA-TACI-shRNA質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染H1299和A549細胞株，空質(zhì)粒作為陰性對照，用細胞劃痕法檢測可溶型APRIL對H1299、A549肺癌細胞生長遷移影響。
　　(3)采用shRNA干擾技術(shù)敲除H1299和A549肺癌細胞系BCMA和TACI基因表達，用CCK-8方法檢測shRNA干擾后H1299和A549肺癌細胞體外培養(yǎng)增殖情況。
　　(4)采用qRT-PCR方法檢測NSCLC患者及正常對

11、照組外周血中APRIL、 BCMA及TACI mRNA的表達水平。
　　(5)采用shRNA干擾技術(shù)敲除H1299和A549肺癌細胞系BCMA和TACI基因表達，用Western blot方法檢測APRIL作用于干擾后的A549和對照組細胞后，對MAP激酶ERK1/2信號磷酸化作用的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)免疫組化結(jié)果顯示，APRIL反應(yīng)活性主要定位于細胞胞漿中。76例肺癌組織中APRIL的陽性表達率為71.7％

12、(54/76)高于癌旁正常組織的陽性表達率10.5％(8/76)，且兩者具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　(2)免疫組化APRIL蛋白表達陽性率與NSCLC臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性分析結(jié)果顯示:APRIL蛋白的表達水平與NSCLC患者臨床病理特征中的性別、年齡、組織學(xué)分類沒有相關(guān)性（P＞0.05），但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、腫瘤分化程度存在密切相關(guān)性(P＜0.05)。
　　(3)免疫組化BCMA蛋白表達陽性率在NSCLC

13、患者中顯著升高(P＜0.05)，與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性顯示:BCMA蛋白的表達與NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤組織學(xué)分類、腫瘤大小、腫瘤分化程度無關(guān)(P＞0.05)，但與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在密切相關(guān)性(P＜0.05)。
　　(4)免疫組化TACI蛋白表達陽性率在NSCLC患者中顯著升高（P＜0.05），與臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性顯示:TACI蛋白的表達與NSCLC患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、腫瘤分化程度無關(guān)（P＞0.0

14、5），但與腫瘤組織學(xué)分類存在密切相關(guān)性(P＜0.05)。
　　(5)可溶型APRIL蛋白能促進H1299和A549細胞的遷移，但對于BCMA和TACI基因干擾的H1299和A549細胞，APRIL蛋白并不能提高其細胞遷移能力。
　　(6)BCMA和TACI基因表達干擾后的肺癌細胞系H1299和A549，與對照組相比，A549細胞生長24h后細胞增殖能力顯著下降(P＜0.05);而H1299細胞則在生長48h后細胞增殖能力顯著

15、下降（P＜0.05）。
　　(7)qRT-PCR結(jié)果顯示: NSCLC患者外周血中APRIL mRNA的表達水平高于正常對照組，具有顯著性差異(P＜0.05)。與臨床病理特征分析結(jié)果顯示:APRILmRNA表達水平與NSCLC患者年齡、性別、病理類型、癌癥分期無關(guān)（P＞0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)(P＜0.05)。而APRIL相關(guān)受體TACImRNA表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度有關(guān)(P＜0.05），BCMA mRNA表

16、達水平則未見與NSCLC患者臨床病理特征有顯著相關(guān)性。
　　(8)可溶型APRIL蛋白可使A549細胞ERK1/2的磷酸化水平升高，且顯著高于正常對照組(P＜0.05)，而對于BCMA和TACI基因表達干擾的A549細胞系，APRIL不能提高其ERK1/2的磷酸化水平。
　　(9)外周血中miR-Let-7c、APRIL mRNA實時定量RT-PCR聯(lián)合檢測，對于診斷NSCLC的敏感度為59.21％(45/76)，特異性為8

17、2.22％(148/180)。
　　結(jié)論:
　　(1)NSCLC患者腫瘤組織及外周血中miR-Let-7c的低表達與NSCLC的發(fā)展和侵襲有密切關(guān)系。
　　(2)外周血中miR-Let-7c可能成為NSCLC診斷、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記物。
　　(3)NSCLC患者組織中APRIL及其相關(guān)受體TACI、BCMA的高表達與腫瘤的發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　(4)APRILmRNA在NSCLC患者外周血中高表達