CHB患者基線HBVcccDNA的PreS-S基因變對(duì)NAs治療后血清HBsAg水平影響的研究.pdf

1、研究背景：HBV最原始模板是HBV cccDNA，而現(xiàn)有的抗病毒治療難以清除肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA。檢測(cè)HBV cccDNA需要肝臟穿刺術(shù)，有風(fēng)險(xiǎn)及禁忌癥，因此各大指南將與HBV cccDNA密切相關(guān)的HBsAg作為HBV cccDNA的替代指標(biāo)而被用于制定終點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)。本團(tuán)隊(duì)建立的抗病毒治療隊(duì)列的研究顯示NAs治療后10年HBsAg累計(jì)清除率僅14％。一項(xiàng)國(guó)外的研究發(fā)現(xiàn)HBV cccDNA與外周血HBsAg量?jī)H呈現(xiàn)低度正相關(guān)。因而，

2、是否有其他的因素影響HBsAg的表達(dá)？PreS/S區(qū)基因變異是否會(huì)導(dǎo)致HBsAg的結(jié)構(gòu)或功能改變，繼而導(dǎo)致現(xiàn)有的檢測(cè)HBsAg試劑靈敏性降低？而目前國(guó)內(nèi)外如此相關(guān)的研究?jī)H為是橫斷面上的探討，且結(jié)果不一。
　　目的：探討CHB患者基線肝組織中HBVcccDNA的Pre S/S基因變異對(duì)NAs治療后外周血HBsAg水平的影響。
　　方法：研究對(duì)象：70例患者均來自本團(tuán)隊(duì)的NAs抗病毒治療隊(duì)列，所有的患者均符合以下入選標(biāo)準(zhǔn)：慢性乙

3、型肝炎患者，診斷符合《2010年中國(guó)慢乙肝防治指南》標(biāo)準(zhǔn)；應(yīng)用NAs抗病毒治療半年內(nèi)獲得病毒學(xué)應(yīng)答（HBV＜1000copies/ml）并維持3年以上;治療基線行肝穿刺，凍存有肝組織及各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清標(biāo)本；隨訪過程中無病毒學(xué)反彈發(fā)生。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并丙型肝炎、丁型肝炎、艾滋病感染者。乙型肝炎病毒攜帶者、急性肝炎、肝硬化、肝癌患者。使用免疫抑制劑、干擾素者。實(shí)驗(yàn)方法：收集患者治療基線時(shí)、抗病毒治療后第二年及第四年隨訪時(shí)的血清及抗病毒治療前的

4、肝穿組織。水煮法提取研究對(duì)象基線的血清中rcDNA，再以rcDNA為模板，應(yīng)用多對(duì)引物及巢式PCR方法檢測(cè)患者的基因型。滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）方法提取肝組織全長(zhǎng)HBV cccDNA,以此為模板應(yīng)用巢式PCR擴(kuò)增肝細(xì)胞HBVcccDNA PreS/S基因，擴(kuò)增產(chǎn)物送生物公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI中標(biāo)準(zhǔn)序列對(duì)比，尋找變異位點(diǎn)。應(yīng)用ELISA方法（羅氏試劑檢測(cè)盒）檢測(cè)基線、抗病毒治療后第2年及第4年血清HBsAg水平。分組方法：將抗病毒治療后

5、第2年至第4年HBsAg下降的幅度<2Log/mL分為A組，下降幅度>2Log/mL為B組。統(tǒng)計(jì)方法：應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析、Fisher’s精確檢驗(yàn)分析可能影響NAs治療后HBsAg水平變化的因素，卡方檢驗(yàn)分析PreS/S突變對(duì)HBsAg水平的影響及可能影響PreS/S突變的因素，以P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：①11/70（15.70%）例發(fā)生Pre S區(qū)大片段堿基缺失，其

6、中5例發(fā)生于Pre S1區(qū)，6例發(fā)生于Pre S2區(qū)。②C基因型患者中PreS基因缺失率明顯高于B基因型患者（25%VS5.8%，P=0.028）。③PreS1區(qū)常見變異位點(diǎn)C2988在B組的發(fā)生率顯著高于A組（90.19%VS52.63%，P＜0.05），PreS2區(qū)常見變異位點(diǎn)A96在B組的發(fā)生率顯著高于A組（84.31%VS52.63%，P=0.006）。④S區(qū)氨基酸sI126變異在B組中的發(fā)生率顯著高于A組（33.33%VS5.