日本血吸蟲(chóng)潛在藥物靶點(diǎn)β-碳酸酐酶的表達(dá)與鑒定.pdf

1、血吸蟲(chóng)病是由血吸蟲(chóng)感染引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的人獸共患病，在我國(guó)廣泛分布于長(zhǎng)江流域及其以南地區(qū)，曾嚴(yán)重影響我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，威脅人民健康，是我國(guó)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，國(guó)家正著手制定血吸蟲(chóng)防治新十年規(guī)劃。吡喹酮是目前治療血吸蟲(chóng)病唯一一個(gè)安全高效的治療藥物，從上世紀(jì)70年代末開(kāi)始使用到現(xiàn)在已有30多年歷史，近年來(lái)在非洲和南美洲的一些曼氏血吸蟲(chóng)流行區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)了對(duì)吡喹酮不敏感的地理株，甚至出現(xiàn)吡喹酮治療無(wú)效的異?，F(xiàn)象，尋找新的藥物靶標(biāo)從而

2、研制出針對(duì)于血吸蟲(chóng)病的新的治療藥物是目前的公共衛(wèi)生需求。β-碳酸酐酶(β-CAs)是自然界中廣泛分布的鋅金屬酶，能高效催化CO2的水合作用，其生理功能多樣，對(duì)諸多生物體的生命活動(dòng)具有重要作用。β-CAs可被磺胺類藥物、氨基磺酸鹽及陰離子等藥物或化合物所抑制，且目前研究顯示β-CAs抑制劑對(duì)部分病原體有體內(nèi)抑制活性。由于β-CAs對(duì)生物體的重要作用，且不分布于脊椎動(dòng)物，是一個(gè)極具吸引力的藥物作用靶點(diǎn)，前景廣闊，有望開(kāi)發(fā)新機(jī)制的廣譜抗菌、抗

3、寄生蟲(chóng)藥物。
　　本研究擬表達(dá)日本血吸蟲(chóng)（Schistosoma japonicum）的潛在藥物靶點(diǎn)β-CA，為抗血吸蟲(chóng)新藥的篩選提供平臺(tái)。首先通過(guò)生物信息學(xué)的方法以保守序列比對(duì)獲得表達(dá)日本血吸蟲(chóng)β-CA的cDNA序列Sjp_0056790.1，并將其在原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行融合表達(dá)。SDS-PAGE及Western blotting初步鑒定表達(dá)蛋白后，采用Ni親和層析方法純化目的蛋白，重折疊復(fù)性之后進(jìn)行碳酸酐酶活性測(cè)定，并進(jìn)一步進(jìn)行日

4、本血吸蟲(chóng)的體外藥物抑制實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證日本血吸蟲(chóng)β-CA作為新機(jī)制的抗日本血吸蟲(chóng)藥物靶點(diǎn)的可行性。
　　最終尋找到的可能編碼日本血吸蟲(chóng)β-CA的氨基酸序列與現(xiàn)已知的多個(gè)β-CAs氨基酸序列在保守序列位置上一致;經(jīng)PCR和雙酶切驗(yàn)證表明，重組表達(dá)載體pET-32a(+)-SjaCA構(gòu)建成功;SDS-PAGE和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示融合蛋白分子量大小約為38kDa，與預(yù)期相符，可被抗His標(biāo)簽抗體識(shí)別;碳酸酐酶活性測(cè)

5、定結(jié)果顯示該表達(dá)蛋白具有與標(biāo)準(zhǔn)品碳酸酐酶相似的催化CO2水合作用的活性，且該活性受碳酸酐酶抑制劑乙酰唑胺(AAZ)抑制。體外藥物抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，日本血吸蟲(chóng)的體外培養(yǎng)可受AAZ抑制，抑制效果達(dá)到微摩爾級(jí)。
　　本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法鑒定了編碼日本血吸蟲(chóng)β-CA的cDNA序列，并成功使用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出具有催化CO2水合作用活性的日本血吸蟲(chóng)β-CA，且該活性受碳酸酐酶抑制劑AAZ的抑制。此外，碳酸酐酶抑制劑AAZ對(duì)日本血吸蟲(chóng)具