乳腺癌缺氧微環(huán)境中HIF-2α誘導腫瘤干細胞形成的研究.pdf

1、引言：
　　腫瘤干細胞(tumor stem cells，TSCs)能夠進行自我更新、無限制地生長并能產(chǎn)生異質性的癌細胞。缺氧微環(huán)境作為腫瘤干細胞壁龕的重要組成部分，和實體腫瘤的進展和預后密切相關，并影響腫瘤中腫瘤干細胞的演進和抗凋亡能力[1,2]。缺氧誘導因子(Hypoxia Inducible Factor，HIF)家族[3-7]包括HIF-1α和HIF-2α，在這些反應中起著關鍵作用。近期研究表明，HIF-2α具有雙重性，可

2、能是致癌基因，也可能是抑癌基因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程中起著關鍵作用，而且 HIF-2α基因在腫瘤干細胞中優(yōu)先表達。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-2α基因在多種人惡性腫瘤組織中（包括乳腺癌）均呈現(xiàn)高表達[8]，可能涉及包括血管生成、腫瘤侵襲轉移、腫瘤干細胞維持、抗凋亡、促進耐藥基因的表達等多個方面，從而加速腫瘤惡性轉變。
　　本研究擬采用生物信息學工具分析 TCGA數(shù)據(jù)庫中1173例乳腺癌測序數(shù)據(jù)，挖掘與缺氧相關的差異表達基因，尋找與HIF-2

3、α有差異表達關系的基因。通過Knock up/down技術分析相互之間的調控關系，明確HIF-2α在乳腺癌MCF-7細胞中的生物學功能，探索其促進乳腺癌腫瘤干細胞發(fā)生的機制。
　　第一部分 TCGA數(shù)據(jù)庫挖掘HIF-2α及其表達相關基因在乳腺癌中表達及驗證
　　目的:
　　檢測HIF-2α與其表達相關基因TGF-β、SMAD2、OCT4在乳腺癌及癌組織中的表達水平。
　　方法:
　　利用生物信息學工具挖掘T

4、CGA數(shù)據(jù)庫，分析1173例浸潤性乳腺癌標本的測序結果中尋找HIF-2α的表達相關基因及其相關通路，分析各個通路中可能與缺氧及腫瘤干細胞相關的基因；利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析HIF-2α在1173乳腺癌組織中的表達情況，探討其表達程度與病人預后的相關性；采用IHC方法檢測45例女性乳腺癌組織中HIF-2α蛋白的表達，并分析其與乳腺癌患者臨床病理的關系；采用Real-time PCR法檢測45例樣本中HIF-2α及其表達相關基因TGF-β、S

5、MAD2、OCT4 mRNA表達情況及與乳腺癌患者臨床病理間的關系。
　　結果:
　　從TCGA數(shù)據(jù)庫中1173例乳腺癌標本測序數(shù)據(jù)中分析獲得165個基因表達與HIF-2α呈正相關，46個基因與HIF-2α呈負相關；與缺氧及腫瘤干細胞形成相關的基因主要聚集在3條路徑上：HIF-1 signaling pathway、MAPK signaling pathway、TGF-βsignaling pathway；TCGA預后數(shù)據(jù)分

6、析顯示，HIF-2α高表達對乳腺癌患者來說意味著更差的預后；
　　免疫組化結果顯示HIF-2α蛋白在乳腺癌組織中的表達顯著高于癌旁組織中的表達，并且HIF-2α蛋白在乳腺癌組織中的表達與腫瘤的淋巴結轉移之間存在顯著相關性 p<0.05；熒光定量 PCR檢測 HIF-2α及其表達相關基因 TGF-β、SMAD2、OCT4在乳腺癌組織中的基因表達水平分別為3.7211±1.4000、6.0131±1.1832、4.5751±1.118

7、4顯著高于癌旁組織P<0.05，與TCGA數(shù)據(jù)庫分析結果一致。
　　小結:
　　通過TCGA數(shù)據(jù)庫信息分析結合免疫組化結果發(fā)現(xiàn)HIF-2α高表達是乳腺癌不良預后的標志；TGF-β、SMAD2、OCT4是缺氧條件下HIF-2α表達相關基因。
　　第二部分 HIF-2α在乳腺癌MCF-7細胞中生物學功能的研究
　　目的:
　　應用慢病毒感染方法獲得MCF-7 HIF-2α knock up/down的穩(wěn)定細胞株

8、，進一步研究HIF-2α對乳腺癌細胞MCF-7細胞的增殖能力、侵襲能力、克隆形成能力和遷移能力等分子機制的影響；
　　方法:
　　利用HIF-2α ORF和HIF-2α shRNA慢病毒分別轉染MCF-7細胞，篩選構建MCF-7 HIF-2α knock up/down的穩(wěn)定細胞株；在MCF-7 HIF-2α knock down細胞株上聯(lián)合CoCl2誘導環(huán)境缺氧，利用Realtime-PCR和Western Blot方法分

9、別檢測HIF-2α及其表達相關基因（TGF-β、SMAD2和OCT4）mRNA和蛋白的表達水平；利用EdU檢測HIF-2α對細胞增殖的影響；利用CCK-8方法檢測細胞活力；細胞遷移能力的變化采用細胞劃痕實驗檢測；細胞侵襲能力變化采用Transwell實驗檢測；細胞的成瘤能力使用平板克隆形成實驗檢測。
　　結果:
　　慢病毒感染后，通過篩選獲得穩(wěn)定的MCF-7 HIF-2α Knock up/down細胞株；Real-time

10、 PCR和Western blot結果顯示在CoCl2誘導的缺氧條件下，HIF-2α及其表達相關基因TGF-β、SMAD2、OCT4表達上調；在MCF-7 HIF-2α knock down細胞株中加入CoCl2，誘導形成缺氧環(huán)境，因RNAi的而存在無法上調HIF-2α的表達，而HIF-2α表達相關基因TGF-β、SMAD2、OCT4表達受到抑制；EdU檢測結果顯示在MCF-7細胞中上調 HIF-2α后，MCF-7細胞的增殖能力增強，即

11、HIF-2α的高表達促進MCF-7細胞增殖；CCK-8檢測證實HIF-2α高表達增強細胞活力，促進MCF-7腫瘤細胞增殖；細胞劃痕實驗表明HIF-2α高表達促進MCF-7腫瘤細胞遷移；Transwell小室實驗顯示HIF-2α高表達促進MCF-7腫瘤細胞的侵襲能力增強；平板克隆形成實驗表明HIF-2α高表達促進MCF-7細胞成瘤。
　　小結:
　　HIF-2α與TGF-β、SMAD2和OCT4表達具有相關性，且HIF-2α能

12、夠增加細胞活力，促進細胞增殖和侵襲遷移；
　　第三部分 HIF-2α對乳腺癌腫瘤干細胞形成的影響
　　目的：
　　探討HIF-2α表達對低氧下乳腺癌腫瘤干細胞特性（Breast Cancer Stem Cells，BCSCs）的影響。
　　方法：
　　采用免疫磁珠法得到人乳腺癌 MCF-7干細胞株，感染慢病毒獲得 MCF-7 CSCs HIF-2α knock up/down細胞株；Realtime-PCR

13、和Western blot檢測HIF-2α、TGF-β、SMAD2、OCT4 mRNA及蛋白在MCF-7 CSCs、MCF-7 CSCsHIF-2α knock up/down細胞株中表達的變化；CCK-8檢測試劑盒檢測HIF-2α對MCF-7 CSC細胞增殖活力的影響；
　　CoCl2聯(lián)合無血清懸浮培養(yǎng)法培養(yǎng)MCF-7 knock up/down細胞株，誘導獲得“乳腺癌腫瘤干細胞（Breast Cancer Stem Cells

14、，BCSCs）微球體”；流式細胞儀被用來檢測細胞的凋亡及乳腺癌腫瘤干細胞標志物 CD44+的表達；裸鼠荷瘤實驗比較MCF-7 Knock up/down腫瘤干細胞的腫瘤生長速度，及成瘤能力。
　　結果：
　　采用表面抗體標記磁納米顆粒法分選獲得的乳腺癌MCF-7干細胞經(jīng)慢病毒感染后篩選獲得MCF-7 CSC HIF-2α knock up/down細胞株；Real-time PCR和Western blot結果顯示在MCF-

15、7 CSC HIF-2α knock up細胞株中，HIF-2α及表達相關基因TGF-β、SMAD2、OCT4表達上調；在MCF-7 HIF-2α knock down細胞株中因RNAi存在而抑制HIF-2α的表達，HIF-2α表達相關基因TGF-β、SMAD2、OCT4表達變化無統(tǒng)計學意義；
　　流式細胞術檢測MCF-7 CSC HIF-2α knock up/down經(jīng)CoCl2聯(lián)合無血清懸浮培養(yǎng)的微球體中乳腺癌腫瘤干細胞標志

16、物CD44+細胞比例顯示，MCF-7 HIF-2α knock up細胞株形成微球體中CD44+細胞比例（91.07％）顯著高于MCF-7（79.21%）和MCF-7 HIF-2α knock down細胞株（51.6%）；CCK-8檢測結果顯示：HIF-2α過表達促進MCF-7 CSC增殖；流式細胞術檢測結果顯示：HIF-2α過表達抑制MCF-7干細胞的凋亡；HIF-2α過表達的MCF-7干細胞成瘤能力明顯高于正常MCF-7干細胞和H

17、IF-2α下調的MCF-7干細胞。
　　小結：
　　缺氧環(huán)境下上調HIF-2α能夠促進MCF-7腫瘤干細胞的形成，并有促增殖作用和抑制MCF-7腫瘤干細胞凋亡，上調MCF-7腫瘤干細胞TGF-β、SMAD2和OCT4蛋白和mRNA的表達。裸鼠荷瘤實驗證實HIF-2α過表達明顯增加MCF-7腫瘤干細胞的成瘤能力。
　　結論
　　1．乳腺癌組織中HIF-2α過表達，可能與乳腺癌的預后相關；
　　2、在缺氧微環(huán)境

18、中TGF-β、SMAD2、OCT4是HIF-2α的表達相關基因；
　　3、在乳腺癌MCF-7細胞及MCF-7干細胞中過表達HIF-2α能夠增強細胞活力，促進細胞增殖，增加腫瘤細胞的侵襲、遷移和成瘤能力；
　　4、缺氧條件下，上調MCF-7細胞中HIF-2α的表達，能夠促進MCF-7 CSCs的發(fā)生；
　　5、HIF-2α過表達的MCF-7 CSCs成瘤能力明顯高于正常MCF-7 CSCs和HIF-2α下調的MCF-7