丁苯酞通過(guò)抗凋亡作用而減輕實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的神經(jīng)損害.pdf

1、目的:多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種以髓鞘脫失、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生、軸索病變和進(jìn)行性神經(jīng)功能障礙為主要特點(diǎn)的常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病。該病病程反復(fù)，致殘率高，加重家庭與社會(huì)負(fù)擔(dān)。但是引起多發(fā)性硬化的確切的病因及其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。目前認(rèn)為是由于環(huán)境因素、遺傳易感性、自身免疫異常、氧化應(yīng)激反應(yīng)等多種因素綜合作用的結(jié)果。
　　細(xì)胞凋亡涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控，是一種由基因調(diào)節(jié)控制的細(xì)

2、胞程序性死亡過(guò)程。目前大量研究已證明:線(xiàn)粒體是內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起至關(guān)重要作用的細(xì)胞器，而線(xiàn)粒體的結(jié)構(gòu)和功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致多發(fā)性硬化和EAE模型中髓鞘脫失、軸索和神經(jīng)元的變性。
　　丁苯酞(dl-3n-butlphalide,NBP)是人工合成的消旋體，2002年，中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局首次批準(zhǔn)丁苯酞可以應(yīng)用于中風(fēng)患者。實(shí)驗(yàn)證明丁苯酞可以通過(guò)改善供血、保護(hù)血腦屏障、抗血栓形成、改善線(xiàn)粒體功能等途徑發(fā)揮腦保

3、護(hù)作用，目前廣泛應(yīng)用在治療缺血性腦血管病方面，并已取得良好效果。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于丁苯酞對(duì)于多發(fā)性硬化是否具有治療作用的研究很少，關(guān)于丁苯酞對(duì)多發(fā)性硬化線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能損傷以及對(duì)多發(fā)性硬化的細(xì)胞凋亡影響，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)觀察對(duì)丁苯酞對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠神經(jīng)細(xì)胞是否具有保護(hù)作用，從而為臨床治療多發(fā)性硬化提供新的方法。
　　實(shí)驗(yàn)

4、性自身免疫性腦脊髓炎是目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的多發(fā)性硬化研究的理想動(dòng)物模型，是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小血管周?chē)鷨蝹€(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)及髓鞘脫失為特征的自身免疫性疾病。本實(shí)驗(yàn)以丁苯酞作為干預(yù)藥物，通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)功能評(píng)分及Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)變化情況，探討丁苯酞能否通過(guò)抗細(xì)胞凋亡作用而減輕實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠神經(jīng)損傷作用，為臨床探索新的治療方法提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)買(mǎi)與飼養(yǎng):選擇健康C57BL/6雌性小

5、鼠45只，周齡介于6-8周，體重在180～220g之間，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。隨機(jī)分籠，以標(biāo)準(zhǔn)飼料、自來(lái)水飼養(yǎng)于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境恒溫20～25℃。
　　2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:將免疫發(fā)病后C57BL/6小鼠36只隨機(jī)分為EAE組(E，生理鹽水0.1ml/d/只)、地塞米松組（D，地塞米松注射液0.07mg/只）、丁苯酞低劑量組（L，丁苯酞80mg/d/只）及丁苯酞高劑量組（H，丁苯酞1

6、20mg/d/只）。另取9只正常小鼠為正常對(duì)照組（N，生理鹽水0.1 ml/d/只）。小鼠發(fā)病當(dāng)天（0天），地塞米松組、丁苯酞低劑量組及高劑量組分別于發(fā)病后每日腹腔注射相應(yīng)劑量藥物。正常組及EAE組僅每日腹腔注射相應(yīng)劑量的生理鹽水，共14天。各組再以發(fā)病后0天、7天、14天分為三個(gè)亞組，每個(gè)亞組3只小鼠。
　　3、EAE模型的建立:用生理鹽水將抗原MOG35-55稀釋成6mg/ml，并按1∶1等體積加入完全弗氏佐劑（加入結(jié)核桿菌H

7、37Ra使其終濃度為4mg/ml），混合乳化。充分乳化后將小鼠用乙醚麻醉，將小鼠充分固定后于小鼠背部脊柱兩側(cè)分四點(diǎn)皮下注射（每只0.1ml），第0h及第48h后腹腔注射0.5ml PTX。正常組小鼠不作上述處理。
　　4、實(shí)驗(yàn)小鼠神經(jīng)功能評(píng)分:自免疫當(dāng)天起每日早晚兩次（間隔約8小時(shí)），由兩名觀察者同時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行稱(chēng)重、神經(jīng)功能評(píng)分。采用國(guó)際通用的Benson（5分）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分:
　　具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:0

8、分無(wú)任何臨床癥狀;1分小鼠尾部張力消失，不能上抬，步態(tài)可見(jiàn)輕度笨拙;2分小鼠雙后肢均無(wú)力，被動(dòng)翻身可恢復(fù);3分小鼠雙后肢癱瘓，被動(dòng)翻身后，不能自行恢復(fù)，但是給予刺激后可以挪動(dòng);4分小鼠雙后肢癱瘓，前肢癱瘓或肌力減弱伴尿便失禁;5分瀕臨死亡或死亡。評(píng)分時(shí)如果小鼠臨床癥狀介于兩個(gè)評(píng)分之間，則選取較低分?jǐn)?shù)加0.5分來(lái)表示。
　　5、取材:于發(fā)病當(dāng)天（0天）:EAE組、正常對(duì)照組各取3只;發(fā)病第7天、14天:EAE組、丁苯酞低劑量組、丁苯

9、酞高劑量組、地塞米松組各取3只;給予10％水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉后，先以生理鹽水心臟灌注（流出液無(wú)血液后），再以4％多聚甲醛經(jīng)心臟灌注后，取脊髓腰膨大處組織常規(guī)石蠟包埋，制成石蠟切片，5μm連續(xù)切片。應(yīng)用Tunel染色法測(cè)定凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目變化情況。
　　結(jié)果:
　　1、實(shí)驗(yàn)小鼠免疫后發(fā)病情況:小鼠在接受免疫后一周左右出現(xiàn)精神萎靡、皮毛不整、活動(dòng)減少、體重下降等。免疫10天后左右小鼠開(kāi)始發(fā)病，表現(xiàn)為尾部上抬

10、無(wú)力，張力消失，肌張力下降，肢體癱瘓、部分出現(xiàn)四肢癱等。
　　2、動(dòng)物神經(jīng)功能評(píng)分
　　發(fā)病后第7天:L7、H7、D7組及E7組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分分別為1.67±0.76、1.50±0.5、1.33±0.29、2.67±0.87， L7、H7及D7組小鼠評(píng)分均小于EAE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），L7、H7及D7組間評(píng)分無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　發(fā)病后第14天:L14、H14、D14組及E14組小鼠的

11、神經(jīng)功能評(píng)分分別為1.17±0.58、1±0.5、1±0、2.17±0.29，L14、H14、D14組小鼠評(píng)分均小于EAE組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，L14、H14及D14組間評(píng)分無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　3、Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù):
　　正常組小鼠脊髓幾乎沒(méi)有Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組小鼠脊髓均有Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞，散在分布于脊髓實(shí)質(zhì)及小靜脈周?chē)５蛲黾?xì)胞可能為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、炎性細(xì)胞等。E0

12、組、E7組、E14組Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為39.33±4.56、40.37±4.23、34.30±4.33，E14組小鼠Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少于E0組及E7組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），E0組與E7組Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異（P＞0.05）。
　　發(fā)病后第7天:L7、H7、D7組及E7組小鼠的Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為23.53±4.92、21.53±3.49、22.67±4.06、40.37±4.2

13、3， L7、H7及D7組小鼠Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均小于EAE組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，L7、H7及D7組Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　發(fā)病后第14天:L14、H14、D14組及E14組小鼠的Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為20.30±3.72、20.27±3.47、21.20±3.89、34.30±4.33，L14、H14、D14組小鼠Tunel染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均小于EAE組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜