A型肉毒素對UVB誘導提前衰老人真皮成纖維細胞長鏈非編碼RNA表達的影響及其分析.pdf

1、研究背景及目的：
　　皮膚老化表現(xiàn)為皺紋形成、色沉增多、彈性下降等，受內(nèi)源性因素和外源性因素的共同影響[1]。內(nèi)源性因素導致的皮膚老化又稱為自然老化，由遺傳和不可抗力（如內(nèi)分泌變化、免疫功能的下降等）導致，是機體自然衰老的體現(xiàn)之一，目前尚不可人為調(diào)控。造成皮膚老化的外源性因素有很多，如紫外線輻射、吸煙、不健康飲食、空氣污染、睡眠質(zhì)量差、化學物質(zhì)刺激等，這些因素是可以人為控制的[2]。雖然相關(guān)機制尚未研究透徹，但目前研究已經(jīng)證明，紫

2、外線輻射是導致皮膚老化的主要因素，某種角度上來講光老化即外源性老化的代稱[3-5]。有關(guān)光老化機制及干預手段的研究一直是皮膚科領(lǐng)域的熱點。
　　A型肉毒素(Botilium Toxin Type A，BoNTA)是肉毒桿菌分泌的七種神經(jīng)毒素中最有效的一種，在臨床得到廣泛應用[6]。BoNTA可引起肌肉松弛，由于它這種肌肉松弛的特性可以使皺紋（主要是動態(tài)性皺紋）得到改善，現(xiàn)已成為皮膚科治療外源性老化的重要手段之一[7.8]。2005

3、年和2008年，一些研究人員發(fā)現(xiàn)在顏面的中下1/3處皮下注射BoNTA，可一定程度地提升面部曲線[9,10]。為了解BoNTA在改善皮膚狀態(tài)中的真實效用，2012年，Sang-Ha Oh等研究了BoNTA對離體狀態(tài)下對正常人真皮成纖維細胞(Human dermal fibrolasts，HDFs)的影響，得出BoNTA具有顯著的提高膠原蛋白產(chǎn)生水平、降低其降解作用的結(jié)論[12]。2014年，本研究小組對于UVB所致光老化的HDFs進行了

4、體外研究，得出了BoNTA可以有效提高COL-Ⅰ及COL-Ⅲ水平，減少MMP-1及MMP-9分泌的結(jié)論[13]。2016年，朱潔等證明了局部應用BoNTA可以增強二氧化碳(cnarbon dioxide，CO2)點陣激光術(shù)后的復原效果，進一步表明BoNTA可以改善皮膚質(zhì)地，使皮膚變得更光滑[14]。這些研究不僅證明了BoNTA對HDFs在改善皮膚狀態(tài)上的積極作用，而且也暗示了HDFs的重要性。
　　長鏈非編碼RNA(Long no

5、n-coding RNA，lncRNA)是一組長度大于200個核苷酸片段、不具有編碼蛋白質(zhì)的功能[15]。隨著基因檢測技術(shù)的進步和相關(guān)知識不斷深入，以前被認為是轉(zhuǎn)錄“噪聲”的LncRNA現(xiàn)在被證明具有一定的功能，lncRNA可通過調(diào)節(jié)基因組印記、染色體修飾、核轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)錄激活、干擾等來參與生物學過程[16,17]。在生理條件下對細胞功能的理解如果忽略了對lncRNAs所發(fā)揮的作用的分析，是不全面的。因此，我們將從研究UVB輻射對正常HDF

6、s、BoNTA對正常HDFs及BoNTA對UVB誘導的提前衰老(UVBinduced premature senescence，UVB-IPS)HDFs中l(wèi)nc-RNA表達的影響著手，研究原來被認為沒有功能的lncRNA在光老化發(fā)生和BoNTA改善皮膚老化中的可能機制及作用環(huán)節(jié)。
　　研究方法：
　　1.各部分實驗的分組
　　從包皮環(huán)切術(shù)后的皮膚分離培養(yǎng)的人真皮成纖維細胞(Human dermalfibrolasts，

7、HDFs)，選處于對數(shù)生長期8-11代的正常HDFs，分別分組如下:
　　(1)第一部分:①對照組;②UVB誘導提前衰老成纖維細胞(UVB-IPS)組:UVB以10mJ/cm2大小能量連續(xù)照射5天，靜置3天。用β-半乳糖苷酶驗證兩組細胞的衰老狀況。
　　(2)第二部分:①對照組;②BoNTA處理組(2.5U48h):BoNTA的處理劑量為2.5U/106細胞，與HDFs共孵育時間為48h;③BoNTA處理組(5U48h):B

8、oNTA的處理劑量為5U/106細胞，與HDFs共孵育時間為48h;④BoNTA處理組(7.5U48h):BoNTA的處理劑量為7.5U/106細胞，與HDFs共孵育時間為48h;⑤BoNTA處理組(5U24h):BoNTA的處理劑量為5U/106細胞，與HDFs共孵育時間為24h;⑥BoNTA處理組(5U72h):BoNTA的處理劑量為5U/106細胞，與HDFs共孵育時間為72h
　　(3)第三部分:①對照組;②BoNTA處理

9、UVB-IPS組(2.5U48h): BoNTA的處理劑量為2.5U/106細胞，與UVB-IPS的HDFs共孵育時間為48h;③BoNTA處理UVB-IPS組(5U48h): BoNTA的處理劑量為5U/106細胞，與UVB-IPS的HDFs共孵育時間為48h;④BoNTA處理UVB-IPS組(7.5U48h): BoNTA的處理劑量為7.5U/106細胞，與UVB-IPS的HDFs共孵育時間為48h;⑤BoNTA處理UVB-IPS組

10、(5U24h):BoNTA的處理劑量為2.5U/106細胞，與UVB-IPS的HDFs共孵育時間為24h;⑥BoNTA處理UVB-IPS組(5U72h): BoNTA的處理劑量為5U/106細胞，與UVB-IPS的HDFs共孵育時間為72h。
　　2.RNA芯片篩選差異表達的RNA(lncRNA和mRNA)及生物信息學分析
　　使用TRIzol提取各組HDFs的總RNAs，進行RNA芯片分析。以歸一化強度的|log2(Rat

11、io)|≥2為條件篩選UVB-IPS的HDFs，BoNTA(5U48h)處理的HDFs和BoNTA(48h5U)處理UVB-SIPS的HDFs中差異表達的lncRNA和mRNA，并對所得差異RNA的靶基因進行GO分析以及pathway富集分析。使用qRT-PCR(Quantitative real time PCR，實時定量PCR)法驗證UVBvs對照組、BoNTA(5U48h) vs對照組、BoNTA處理UVB-IPSvs對照組按照設

12、定原則篩選的lncRNA和mRNA。
　　3、qRT-PCR法進一步驗證篩選出來的lncRNA和mRNA
　　利用qRT-PCR法對篩選出來的各造模組中均差異表達的RNA(FGFR3P，COL19A1)進行進一步驗證:即檢測在BoNTA(5U48h) vs對照組、BoNTA處理UVB-IPSvs對照組中FGFR3P和COL19A1表達水平隨BoNTA劑量、時間不同發(fā)生的變化。
　　結(jié)果：
　　1.UVB誘導提前衰

13、老HDFs中l(wèi)ncRNA的篩選及初步分析:(1)以亞毒性計量的UVB(10m J/cm2)多次（5次）照射HDFs后，β-半乳糖苷酶陽性率顯著高于未照光組(P＜0.05)。(2)利用差異倍數(shù)Fold change值進行篩選，設定差異倍數(shù)(Fold change，F(xiàn)C)值≥2時與對照組相比較，UVB誘導光老化HDFs中檢測出差異表達的lncRNA和mRNA數(shù)分別為3224和1630個:生物信息學分析提示，差異表達的lncRNA涉及多種生物

14、學功能，部分生物學功能與光老化有關(guān)，如:細胞對UVB的反應、自噬、細胞凋亡等。(3)選擇出來RNAs的qRT-PCR的結(jié)果與RNA芯片分析結(jié)果趨勢一致，證明芯片分析結(jié)果的可靠性。
　　2.A型肉毒毒素處理后人真皮成纖維細胞長鏈非編碼RNA表達譜的篩選及初步分析:(1)與對照組相比較，BoNTA以5U/106細胞的劑量孵育48h后，設定FC≥2時，HDFs中差異表達的lncRNA和mRNA數(shù)分別為2124和638個。(2)生物信息學

15、分析提示，差異表達的lncRNA涉及多種生物學功能，部分生物學功能與皮膚老化有關(guān)，如:膠原蛋白的產(chǎn)生、細胞增殖等。(3)初步選擇出來RNAs的qRT-PCR的結(jié)果與芯片分析結(jié)果趨勢一致;篩選出來FGFR3P和COL19A1的qRT-PCR驗證結(jié)果說明BoNTA對FGFR3P和COL19A1表達的調(diào)控有一定的時間及劑量相關(guān)性。
　　3.A型肉毒毒素處理對UVB-IPS的HDFs中l(wèi)ncRNA表達譜的影響:(1)與對照組相比較，BoN

16、TA以5U/106細胞的劑量孵育48h后，設定FC≥2時，UVB-IPS的HDFs中差異表達的lncRNA和mRNA數(shù)分別為1651和1221個。(2)生物信息學分析提示，差異表達的lncRNA涉及多種生物學功能，部分生物學功能與皮膚老化有關(guān)，如:如有絲分裂細胞周期G1/S間轉(zhuǎn)換、成纖維細胞增殖、膠原蛋白產(chǎn)生、細胞老化等。(3)初步選擇出來RNAs的qRT-PCR的結(jié)果與芯片分析結(jié)果趨勢一致;進一步的qRT-PCR驗證結(jié)果表明BoNTA