類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液免疫復(fù)合物對成纖維樣滑膜細(xì)胞功能影響的研究.pdf

1、目的:
　　1.取RA和OA患者關(guān)節(jié)液中提取的抗瓜氨酸化肽特異性免疫復(fù)合物(anti-citrullinated peptide antibody specific immune complexes，ACPA-ICs)，在不同IC濃度梯度下，分別對RA患者關(guān)節(jié)FLSs進(jìn)行刺激，以探討ACPA-IC對FLSs增殖功能的影響。
　　2.取RA和OA患者關(guān)節(jié)液中提取的ACPA-IC，在不同IC濃度梯度下，分別
　　對RA患者

2、關(guān)節(jié)FLSs進(jìn)行刺激，用ELISA法檢測細(xì)胞上清中IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3的含量，以探討ACPA-IC對FLSs CKs和MMPs分泌功能的影響。
　　3.分別從RA和OA患者關(guān)節(jié)滑膜組織(synovial tissue，ST)提取蛋白，并對兩組蛋白進(jìn)行鑒定。
　　4.將從RA和OA患者ST中提取的蛋白進(jìn)行western blot檢測，以分析RA和OA患者ST中PADI4的表達(dá)量是否存在差異。同時，對RA

3、患者血清抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(抗CCP)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、抗鏈球菌溶血素O(anti-streptolysin，ASO)和RF等相關(guān)實驗指標(biāo)進(jìn)行檢測，以期研究滑膜組織中PADI4的表達(dá)量與臨床相關(guān)實驗指標(biāo)是否具有相關(guān)性。進(jìn)一步探討PADI4在RA中的致病作用。
　　方法:
　　1.采用G蛋白免疫親和層析法，從RA患者和OA患者關(guān)節(jié)液中提取IC，BCA法檢測提取后各組ICs蛋白質(zhì)濃度;C

4、LIA法檢測提取后及混合前后各組IC中ACPA的濃度。
　　2.無菌條件下獲取手術(shù)切除的RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織，分離純化FLSs，并進(jìn)行體外培養(yǎng)，取第4～7代細(xì)胞進(jìn)行實驗刺激。
　　3.用純化后的各組IC刺激RA FLSs，CCK-8法檢測刺激后FLSs的增殖情況。4.用ELISA法分析IC刺激RA FLSs后細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3的分泌情況。
　　5.無菌條件下獲取手術(shù)切除的RA和

5、OA患者的關(guān)節(jié)ST，液氮研磨提取蛋白，western blot法檢測ST中PADI4蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.RA-IC刺激對RA FLSs增殖的影響
　　與對照組OA-IC組和空白對照組(BC)相比，四種濃度(25μ g/ml、50μ g/ml、100μ g/ml、200μ g/ml)的ACPA-IC刺激FLSs48h后，對FLSs增殖有一定抑制作用，且在25μ g/ml、50μ g/ml和100μg/ml

6、三個濃度均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，但隨著濃度的升高，抑制作用逐漸減弱;OA-IC和BC組相比，對FLSs的增殖無作用。
　　2.關(guān)節(jié)液RA-IC刺激對RA FLSs分泌CKs功能的影響
　　ACPA-IC刺激FLSs24-72h后，在細(xì)胞培養(yǎng)上清中可測到大量IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3，其水平顯著高于OA-IC刺激組(P＜0.05)。其中50μ g/ml、100μ g/ml和200μ g/ml的RA-I

7、C組刺激后，F(xiàn)LSs分泌GM-CSF和IL-6量均顯著高于OA-IC組和BC組。RA-IC刺激FLSs分泌IL-8的作用最強(qiáng)，四種刺激濃度，其含量均明顯高于OA-IC組與BC組，且差異顯著(P＜0.01)。而MMP-3僅在RA-IC刺激濃度為100μ g/ml和200μ g/ml時，與OA-IC組和BC組存在顯著性差異(P＜0.01)。提示低濃度時，關(guān)節(jié)液RA-IC對FLSs刺激MMP-3分泌作用較弱。OA-IC組與BC組間刺激作用差異

8、并不明顯，僅在低濃度時，兩組MMP-3分泌水平存在些許差異。同時，三組中IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3分泌水平均隨著時間增加而增加，說明二者間也存在一定正相關(guān)性。
　　3.滑膜組織提取蛋白鑒定
　　分別取等量RA和OA患者滑膜組織提取蛋白混合，蛋白質(zhì)定量后用于后續(xù)實驗。SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示，RA組出現(xiàn)若干OA組中沒有的條帶，在電泳圖上25KDa和55KDa位置可見兩條深染條帶，分別為抗體Ig的輕鏈和重鏈

9、部分。
　　4.RA、OA患者ST PADI4表達(dá)水平
　　RA患者ST的PADI4的表達(dá)水平明顯高于OA患者(P＜0.05)，但未發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平的高低與患者血清中抗CCP、RF、CRP和ASO水平存在相關(guān)關(guān)系。
　　結(jié)論:
　　1.RA患者關(guān)節(jié)液中較高水平的ACPA-IC對FLSs增殖具有一定抑制作用，隨刺激濃度升高抑制作用逐漸減弱，但低刺激濃度和更高刺激濃度的作用尚需進(jìn)一步的實驗證實。
　　2.RA患者

10、關(guān)節(jié)液IC可刺激FLSs分泌高水平的IL-6、IL-8、GM-CSF和MMP-3，提示ACPA-IC中含有的瓜氨酸化蛋白(citrullinated protein，CitP)或ACPA可能在刺激FLSs分泌CKs和MMPs的過程中發(fā)揮重要作用。
　　3.SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示，RA組存在若干OA組中沒有的條帶，其中可能含有瓜氨酸化的蛋白及可與鼠抗PADI4抗體結(jié)合的抗原成分。
　　4.通過檢測RA及OA患者ST PA