重組腺病毒介導(dǎo)的CXCR7基因沉默增強(qiáng)肝癌SMMC-7721細(xì)胞對(duì)TRAIL敏感性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性肝癌指起源于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞的癌癥，是惡性程度極高的腫瘤之一。其發(fā)病率目前在全球逐漸上升。據(jù)報(bào)道:全世界每年有近62萬(wàn)人被確診為原發(fā)性肝癌，由肝癌所致死亡病例每年約60萬(wàn)，其發(fā)病率和致死率分別位居全球惡性腫瘤排名的第六位和第二位。而我國(guó)是肝癌發(fā)病率最高的國(guó)家之一，每年約有55％新發(fā)肝癌病例發(fā)生在中國(guó)。手術(shù)治療、化療和放療仍是目前治療肝癌的主要手段，但隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展及對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的不斷深入研究，

2、生物治療已成為手術(shù)、化療和放療治療腫瘤的重要輔助治療手段，或者在某種程度上已成為第四種治療腫瘤的重要手段，被喻為腫瘤的“綠色療法”。腫瘤生物治療是通過運(yùn)用一種或多種生物學(xué)技術(shù)來提高腫瘤患者機(jī)體自身的免疫力對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行殺傷，防止腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，而對(duì)正常機(jī)體影響降至最低的一種治療新方法。目前，生物治療腫瘤的技術(shù)主要包括三種:腫瘤基因治療、腫瘤的生物細(xì)胞免疫治療及腫瘤干細(xì)胞的靶向治療。其中，轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默技術(shù)自1998年Fire等首次

3、報(bào)導(dǎo)以來，引起了醫(yī)學(xué)界廣泛的關(guān)注，并將其視為具有開創(chuàng)性意義的攻克癌癥基因治療的突破點(diǎn)。
　　腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)是新近發(fā)現(xiàn)的TNF超家族成員之一。它可以選擇性地對(duì)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡，而對(duì)機(jī)體正常組織細(xì)胞不產(chǎn)生凋亡誘導(dǎo)和毒性作用。隨著對(duì)TRAIL的研究不斷深入，目前TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡的機(jī)制已經(jīng)闡明，典型表現(xiàn)是依賴于Caspase的激活

4、和級(jí)聯(lián)反應(yīng)。即通過TRAIL與死亡受體結(jié)合后募集Caspase8前體形成死亡受體復(fù)合物(death-inducing signaling complex，DISC)，從而激活Caspase8前體形成裂解產(chǎn)物來激活下游Caspase3前體產(chǎn)生級(jí)聯(lián)效應(yīng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但部分腫瘤細(xì)胞卻對(duì)TRAIL誘導(dǎo)的凋亡具有天然或獲得性耐受性，這在很大程度上限制了TRAIL在臨床腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用。大量研究表明，在體外幾乎所有的肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系均對(duì)TR

5、AIL表現(xiàn)不同程度的耐受性，某些基因的過表達(dá)是導(dǎo)致凋亡信號(hào)終止的重要因素。因此，尋找并降低某基因的表達(dá)可能是克服肝癌細(xì)胞對(duì)TRAIL耐受的重要方法。
　　CXCR7作為最近研究發(fā)現(xiàn)一種新的趨化因子受體，對(duì)腫瘤的影響是多方面的。有研究報(bào)道CXCR7可以通過Akt信號(hào)通路的激活來阻礙腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而使腫瘤細(xì)胞的存活能力得以增強(qiáng)。而活化后的Akt通路可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的耐受性。陳等研究證實(shí)在肝癌細(xì)胞中活化的Akt信號(hào)通路

6、可以使肝癌細(xì)胞對(duì)TRAIL產(chǎn)生耐受性。那么，下調(diào)CXCR7的表達(dá)是否能增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性呢？因此本課題以我國(guó)自行研究的肝癌SMMC-7721細(xì)胞作為研究對(duì)象，構(gòu)建并篩選出沉默效率最高的一組shRNA-CXCR7腺病毒表達(dá)載體，通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究下調(diào)CXCR7的表達(dá)聯(lián)合TRAIL是否能對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞及裸鼠移植瘤的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。
　　方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:人肝

7、癌SMMC-7721細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海研究所細(xì)胞庫(kù)。6周齡體重18-20克BALB/c裸鼠20只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。
　　二、主要研究方法
　　1、通過RNA干擾技術(shù)構(gòu)建3組shRNA-CXCR7腺病毒表達(dá)載體，RT-PCR和Weston Blot篩選出沉默效率最高的shRNA-CXCR7
　　2、MTT法檢測(cè)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖。
　　3、AnnexinⅤ-FITC/PI檢

8、測(cè)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的凋亡率。
　　4、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝癌SMMC-7721細(xì)胞侵襲力。
　　5、RT-PCR、Western blot法檢測(cè)肝癌SMMC-7721細(xì)胞中CXCR7、Caspase-3，8和MMP-2，9的表達(dá)。
　　6、構(gòu)建肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠移植瘤模型。
　　7、免疫組化和Weston Blot檢測(cè)肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠移植瘤瘤體標(biāo)本VEGF的表達(dá)。

9、>　　8、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有數(shù)據(jù)均用Graphpad prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，做圖。采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1、成功構(gòu)建及包裝三組腺病毒載體Ad-CMV-shRNA-CXCR7-1、2、3-eGFP-1，并篩選出沉默效率最高的一組Ad-CMV-shRNA-CXCR7-3-eGFP-1用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，病毒滴度為:3.85×108pfu/ml;
　　2、下調(diào)CXC

10、R7可增強(qiáng)TRAIL對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制作用;
　　3、下調(diào)CXCR7增強(qiáng)肝癌SMMC-7721細(xì)胞對(duì)TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性;
　　4、Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TRAIL聯(lián)合shRNA-CXCR7組明顯抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞的侵襲;
　　5、下調(diào)CXCR7后，經(jīng)TRAIL處理，作用48h后，肝癌SMMC-7721細(xì)胞對(duì)其的敏感性增加，且明顯激活了Caspase-3，8，說明CX

11、CR7通過抑制Caspase-3，8的活化，參與了肝癌細(xì)胞SMMC-7721對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的耐受;
　　6、下調(diào)CXCR7后，經(jīng)TRAIL處理，作用48h后，明顯抑制了MMP-2，9的表達(dá)，從而降低了SMMC-7721細(xì)胞的侵襲能力;
　　7、TRAIL和/或shRNA-CXCR7都可以在不同程度上抑制腫瘤的生長(zhǎng)，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，TRAIL抑制腫瘤增長(zhǎng)的作用明顯減弱。而實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)TRAIL聯(lián)合shRNA-CXCR7組

12、裸鼠移植瘤體積增幅最小，質(zhì)量最輕。進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞CXCR7的表達(dá)可進(jìn)一步增強(qiáng)裸鼠移植瘤對(duì)TRAIL的敏感性;
　　8、TRAIL聯(lián)合shRNA-CXCR7能更顯著的降低肝癌SMMC-7721細(xì)胞裸鼠移植瘤VEGF的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1、本研究通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明，抑制肝癌SMMC-7721細(xì)胞CXCR7表達(dá)能夠明顯增強(qiáng)TRAIL殺傷肝癌SMMC-7721細(xì)胞的能力;