自噬在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠神經(jīng)元退行性變中的作用及機(jī)制探討.pdf

1、目的:多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）自動(dòng)免疫性疾病，神經(jīng)退行性變與炎性脫髓鞘均為其重要病理特征。多發(fā)性硬化疾病早期階段開始出現(xiàn)神經(jīng)元退行性變，是多發(fā)性硬化病人神經(jīng)功能持續(xù)、進(jìn)行性損害的主要原因。多發(fā)性硬化神經(jīng)元退行性變的病理機(jī)制迄今未明，與炎癥、氧化應(yīng)激、軸漿內(nèi)Ca2+聚集、谷氨酸興奮毒性、線粒體失功能、蛋白聚集和碳素化等多種機(jī)制有關(guān)。<

2、br>　　自噬是將細(xì)胞內(nèi)多余或受損的細(xì)胞器、折疊蛋白和侵入的病原體運(yùn)送至溶酶體進(jìn)行消化降解的通路。自噬對(duì)T細(xì)胞具有前存活和前死亡雙重作用，是免疫和炎癥重要介導(dǎo)者。同時(shí)，自噬在維持神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，參與多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制，如阿爾茨海默病、Huntington's病、帕金森氏病和肌萎縮性側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)。最近實(shí)驗(yàn)研究顯示，多發(fā)性硬化病人和EAE小鼠T細(xì)胞及腦組

3、織自噬相關(guān)基因5(autophagyassociated gene，Atg5)水平明顯升高，這提示自噬與多發(fā)性硬化病理存在某種特定的聯(lián)系。但是，自噬在多發(fā)性硬化神經(jīng)退行性病變的作用未見相關(guān)報(bào)道。
　　目前認(rèn)為，調(diào)節(jié)自噬活性是神經(jīng)退行性疾病潛在且頗具前景的治療手段。雷帕霉素是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)(mammalian target ofrapamycin，mTOR)抑制劑和最為經(jīng)典的自噬藥理誘導(dǎo)劑，經(jīng)證實(shí)可以有效緩解多發(fā)性硬化病人和E

4、AE模型小鼠病情，然而是否減輕神經(jīng)元退行性變未見相關(guān)報(bào)道。目前多發(fā)性硬化的治療主要是針對(duì)抗炎和免疫調(diào)節(jié)，這些治療可以有效緩解多發(fā)性硬化急性期病情，但不能改善繼發(fā)的長(zhǎng)期進(jìn)行性神經(jīng)功能缺失。深入研究自噬在多發(fā)性硬化神經(jīng)元退行性變的發(fā)病機(jī)制為制定新的有效治療策略奠定基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)性腦脊髓膜炎小鼠模型(Experimental autoimmuneencephalomyelitis，EAE)是研究多發(fā)性硬化神經(jīng)元退行性變的理想模型。本實(shí)

5、驗(yàn)觀察自噬活性的時(shí)序表達(dá)和調(diào)節(jié)通路的活性改變，以及自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素在EAE神經(jīng)元損傷的效果，旨在初步探討自噬與多發(fā)性硬化神經(jīng)退行性變發(fā)病機(jī)制中的可能聯(lián)系，為多發(fā)性硬化治療尋找新靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.實(shí)驗(yàn)材料
　　雌性C57BL/6純系小鼠，鼠齡6-8周，體重18-20 g，購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（北京，中國(guó)）。小鼠飼養(yǎng)于室溫(24±2℃)無菌環(huán)境中，維持光與暗12小時(shí)交替循環(huán)，提供足夠的食物和潔凈水。

6、所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)和當(dāng)?shù)貙?shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
　　2.EA模型的建立和評(píng)價(jià)將抗原MOG35-55用生理鹽水稀釋成5mg/ml，并按1∶1等體積加入CFA，加入結(jié)核桿菌H37Ra使其終濃度為4mg/ml，充分混合乳化。乳化后按每只0.1ml于C57BL/6小鼠脊柱兩側(cè)分四點(diǎn)皮下注射，第0h及第48h腹腔注射0.5ml PTX（500ng/只）。免疫當(dāng)天起采用國(guó)際通用的5分制法對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)

7、估，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:0分無癥狀;1分尾部失去張力;2分后肢力弱;3分后肢癱瘓;4分后肢及前肢癱瘓;5分瀕臨死亡或死亡。當(dāng)臨床癥狀介于兩個(gè)評(píng)分之間時(shí)以較低分?jǐn)?shù)加0.5分表示。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組及治療為了研究EAE小鼠脊髓自噬活性的時(shí)序變化，C57BL/6小鼠被隨機(jī)分成數(shù)目相同的兩組:空白對(duì)照組和EAE模型組。每組又根據(jù)免疫后不同時(shí)期分成鼠齡匹配的三個(gè)亞組:發(fā)病前期組（13天）、發(fā)病高峰期組(20天)和發(fā)病晚期組(30d)。

8、　　為了研究自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素對(duì)EAE小鼠神經(jīng)元的影響，C57BL/6小鼠被隨機(jī)分成數(shù)目相同的三組:空白對(duì)照組（Control）、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（EAE-Vehicle）、雷帕霉素治療組(EAE-Rapamycin)。雷帕霉素治療組自免疫當(dāng)日起腹腔注射雷帕霉素(Sigma)(1mg/kg)，每日一次。實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠自免疫當(dāng)日起每日腹腔注射等量的滅菌水，每日一次。治療至疾病高峰期處死小鼠。
　　4.自噬流分析
　　為了分析EAE小

9、鼠脊髓自噬流導(dǎo)向，C57BL/6小鼠被隨機(jī)分成數(shù)目相同的4組:空白對(duì)照組（正常小鼠+溶劑）、氯喹組（正常小鼠+氯喹）、EAE模型對(duì)照組（EAE模型小鼠+溶劑）、氯喹-EAE模型治療組（EAE模型小鼠+氯喹）。每個(gè)亞組各5只小鼠。各組小鼠自EAE發(fā)病起（臨床癥狀≥1.0）腹腔注射溶劑（0.1ml生理鹽水）或氯喹(Sigma-Aldrich，Milano，Italy)(60mg/kg)，每日一次，連續(xù)給藥7天。通過比較氯喹存在和缺失情況下L

10、C3-Ⅱ蛋白水平的不同來確定EAE小鼠脊髓自噬流導(dǎo)向。
　　5.Nissl染色免疫后第17-21天，每組各取5只小鼠，經(jīng)水合氯醛麻醉后，4％多聚甲醛灌流，取脊髓腰骶段石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，進(jìn)行Nissl染色和TUNEL染色。切片脫蠟至水后依次經(jīng)過焦油堅(jiān)牢紫水溶液浸染，蒸餾水沖洗，95％酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片保存。按照下列標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目:(1)位于脊髓前角腹側(cè)至中央管腹側(cè)末端連線之間區(qū)域的神經(jīng)元;(2)20微

11、米或以上直徑的神經(jīng)元;和(3)不同的核仁神經(jīng)元。
　　6.免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡免疫后20d的腰髓標(biāo)本經(jīng)4％多聚甲醛固定后制作成厚度為30um的冰凍切片。切片用0.01M PBS清洗，5分鐘×3次。切片用0.01M PBS清洗，10分鐘×3次。接下來用0.3％Triton(X)-100打孔約20分鐘，之后用10％馬血清封閉1小時(shí)，再浸在加有相應(yīng)一抗的96孔板中孵育，4℃搖床過夜。次日，用0.01M PBS洗5分鐘×3次，之后避

12、光浸于已加入相應(yīng)二抗的96孔板中孵育1小時(shí)，再次0.01M PBS洗3次，蒸餾水中浸泡數(shù)秒鐘，放于擦凈的載玻片上，避光晾干，之后滴一滴淬滅劑，封片。
　　7.TUNEL染色神經(jīng)細(xì)胞凋亡是由末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)(Roche，Mannheim，Germany)測(cè)定。參照TUNEL試劑盒說明書，脊髓組織切片經(jīng)過TUNEL反應(yīng)液、Alexa fluor568-共軛-鬼筆環(huán)肽、DAPI染色。組織切片

13、在Olympus顯微鏡(Olympus BX51，Tokyo，Japan)下觀察。計(jì)算在15隨機(jī)選擇的視野TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核的平均值，并以視野內(nèi)標(biāo)記的細(xì)胞核的百分?jǐn)?shù)表示。
　　8.Western blot分析從脊髓腰膨大中提取總蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度上樣、電泳，濃縮膠:80V;分離膠:100V，直到所需marker條帶跑完后停止電泳。電泳結(jié)束后使用轉(zhuǎn)移電泳裝置，在4℃100V恒壓條件下電轉(zhuǎn)120min，將蛋白轉(zhuǎn)

14、移到PVDF膜上。用封閉液（含5％脫脂牛奶的TBST溶液）室溫封閉PVDF膜1h。一抗孵育:封閉液稀釋p-AKT、ATK、 p-p70S6K、p70S6K、LC3-Ⅱ、Beclin1、Bcl-2、Bax和GAPDH抗體，與封閉好的PVDF膜4℃過夜。二抗孵育:用封閉液稀釋相應(yīng)的二抗，室溫下孵育PVDF膜2h。加ECL、曝光、顯影、定影。
　　9.統(tǒng)計(jì)方法
　　采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各項(xiàng)指標(biāo)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（

15、(x)±s）;臨床神經(jīng)功能評(píng)分資料應(yīng)用Mann-Whitney U檢驗(yàn);其余計(jì)量資料均數(shù)的兩組間比較應(yīng)用ANOVA方差分析。p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.與空白對(duì)照組對(duì)比，C57BL/6小鼠脊髓LC3-Ⅱ蛋白水平在免疫后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)（13天、20天、30天）均上調(diào)，免疫后20天最為顯著，30天時(shí)降低。EAE小鼠脊髓Beclin1蛋白水平的時(shí)序變化與LC3-Ⅱ相反。與空白對(duì)照組比較，免疫后13天EAE小鼠脊髓

16、Beclin1蛋白水平下調(diào)，免疫后20天降至最低點(diǎn)，免疫后30天回升至空白對(duì)照組水平。
　　疾病高峰期（約免疫后20天作用），氯喹-空白對(duì)照組與溶劑-空白對(duì)照組相比，小鼠脊髓LC3-Ⅱ水平升高。而EAE-溶劑對(duì)照組和EAE-氯喹治療組LC3-Ⅱ水平無顯著差異。
　　2.在疾病高峰期，EAE小鼠腰膨大節(jié)段，LC3主要定位于神經(jīng)元，其次為少突膠質(zhì)細(xì)胞，很少定位于星形膠質(zhì)細(xì)胞。與鼠齡匹配的正常對(duì)照組相比，EAE小鼠LC3與NeuN

17、熒光共定位現(xiàn)象明顯增多。
　　3.免疫后13天EAE小鼠脊髓p-Akt(Ser473)水平輕度減少，免疫后20天其磷酸化水平明顯升高，免疫后30天有所回落。p-p70S6K(Thr389)時(shí)序性變化與p-Akt水平基本一致。而總Akt和p70S6K無顯著改變。雷帕霉素治療導(dǎo)致EAE小鼠脊髓LC3-Ⅱ蛋白水平以及Beclin1蛋白水平顯著增加，磷酸化Akt和p70S6K水平降低。
　　4.雷帕霉素治療組可以延遲小鼠疾病癥狀發(fā)生

18、的時(shí)間，但無明顯差別。發(fā)病高峰期和發(fā)病晚期雷帕霉素均可明顯減輕神經(jīng)功能評(píng)分。與空白對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組和雷帕霉素治療組Nissl染色陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目和NeuN染色陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目減少。雷帕霉素治療組較實(shí)驗(yàn)對(duì)照組Nissl染色陽(yáng)性神經(jīng)元和NeuN-陽(yáng)性神經(jīng)元增多。
　　5.與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，在EAE發(fā)病高峰期，雷帕霉素治療組小鼠前凋亡蛋白Bax水平下降，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平上調(diào)，Bax/Bcl-2比值上升。與空白對(duì)照組相比，實(shí)

19、驗(yàn)對(duì)照組和雷帕霉素治療組小鼠脊髓腰膨大節(jié)段TUNEL-陽(yáng)性凋亡細(xì)胞明顯增多。而與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組比較，雷帕霉素治療組脊髓腰膨大TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量略有減少，統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著差異。與westernblot結(jié)果一致，免疫熒光共聚焦顯示雷帕霉素治療小鼠比實(shí)驗(yàn)對(duì)照組小鼠脊髓bcl-2陽(yáng)性神經(jīng)元明顯增多，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異。
　　結(jié)論:
　　1.EAE小鼠脊髓自噬流受損導(dǎo)致自噬小體降解阻滯、聚集于神經(jīng)元，提示自噬缺陷可能是EAE小鼠神經(jīng)元退行性

20、變的發(fā)病機(jī)制之一。
　　2.Akt/mTOR/p70S6K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與介導(dǎo)EAE小鼠自噬活性，而雷帕霉素通過抑制該通路能夠有效恢復(fù)EAE小鼠脊髓自噬活性。
　　3.雷帕霉素能夠明顯緩解EAE小鼠急性期神經(jīng)功能缺失癥狀，減輕脊髓神經(jīng)元損傷。其原因可能與雷帕霉素通過誘導(dǎo)自噬促進(jìn)神經(jīng)元聚集的蛋白質(zhì)清除，抑制Bax-依賴的凋亡、抗炎等綜合作用的結(jié)果。
　　4.雷帕霉素即具有強(qiáng)大的抗炎、抑制免疫作用，又有神經(jīng)保護(hù)作用，是理想