斑塊破裂伴血栓形成小鼠模型的建立及其相關機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 動脈粥樣硬化斑塊破裂合并血栓形成是急性冠脈綜合征的主要病因和發(fā)病機制，良好的動物模型對于研究其可能的發(fā)生機制以及探討開發(fā)有效的預防措施和治療手段具有重要意義。然而，目前的動物模型雖可形成具有脂質核心大、纖維帽薄等易損特征的斑塊，但斑塊破裂、血栓形成卻罕見發(fā)生。多個實驗室嘗試通過改變斑塊內(nèi)某一基因如p53、MMP-9、尿激酶等表達，以增加斑塊易損性，從而誘發(fā)斑塊急性事件，但始終未見與人類罪犯病變相似的斑塊破裂和血

2、栓形成。這提示只改變單一途徑可能不足以誘發(fā)斑塊破裂。精神應激是人類急性冠脈綜合征的常見觸發(fā)因素。我們實驗室曾通過頸動脈套管的方法誘發(fā)頸動脈斑塊形成，并給予慢性精神應激作為觸發(fā)因素，發(fā)現(xiàn)近70％頸動脈斑塊發(fā)生破裂，表現(xiàn)為纖維帽不連續(xù)或埋藏纖維帽，然而附壁血栓形成仍然少見。
　　 高致栓狀態(tài)是臨床急性冠脈綜合征患者常見伴發(fā)狀態(tài)，對病情進展及預后具有重要影響。Kuijpers等采用高頻超聲波破壞ApoE-/-小鼠成熟斑塊肩部完整性，發(fā)

3、現(xiàn)雖然斑塊破裂口處迅速發(fā)生血小板粘附，但僅形成體積很小的單一血栓。另一方面，Carrie等報道約20％Npc1-/-(:)ApoE-/-小鼠在主動脈根部斑塊出現(xiàn)了附壁血栓，進一步研究發(fā)現(xiàn)這可能與Npc1-/-(:)ApoE-/-小鼠體內(nèi)凝血水平升高有關。這些研究結果提示凝血水平相對低下可能是目前ApoE-/-小鼠斑塊發(fā)生破裂后很少形成血栓的重要因素。
　　 基于以上分析，我們提出以下假說:通過給予ApoE-/-小鼠體內(nèi)過表達凝血

4、酶原增加血液致栓性，聯(lián)合精神應激作為斑塊破裂觸發(fā)因素，可構建具有高斑塊破裂率和高血栓形成率的“雙高”動物模型。
　　 研究目的：
　　 1、通過體內(nèi)過表達凝血酶原、聯(lián)合精神應激，構建ApoE-/-小鼠頸動脈斑塊破裂合并血栓形成的動物模型;
　　 2、探討該模型中參與導致斑塊急性事件發(fā)生的可能原因和機制。
　　 研究方法：
　　 1、構建攜帶小鼠凝血酶原基因的腺病毒載體(Ad-ProT)，以只攜帶綠

5、色熒光蛋白基因的腺病毒空載體(Ad-EGFP)為對照。
　　 2、實驗動物分組及處理:動物實驗分為四部分，共采用170只雄性ApoE-/-小鼠，所有小鼠均于12周齡時進行頸動脈套管術，實驗全程給予高脂飲食:
　　 第一部分(n=20):為觀察腺病毒轉染效率及時間變化，20只ApoE-/-小鼠于頸動脈套管術后11周經(jīng)尾靜脈注射轉染Ad-ProT(5×109ifu)，分別于轉染前、轉染后4天、1周、2周和3周各取材5只小鼠，

6、觀察各時間點腺病毒轉染效率及分布;
　　 第二部分(n=104):為觀察凝血酶原過表達聯(lián)合精神應激對斑塊破裂和血栓形成的影響，104只ApoE-/-小鼠于頸動脈套管術后11周隨機分為以下4組:
　　 (1)凝血酶原過表達+精神應激組（Ad-ProT+Stress組，n=26）:轉染Ad-ProT，并進行精神應激;
　　 (2)凝血酶原過表達組（Ad-ProT組，n=26）:只轉染Ad-ProT，不進行精神應激;<

7、br>　　 (3)精神應激組（Stress組，n=26）:轉染Ad-EGFP，并進行精神應激;
　　 (4)對照組（Unstress組，n=26）:只轉染Ad-EGFP，不進行精神應激。
　　 所有小鼠均于頸動脈套管術后11周經(jīng)尾靜脈注射進行相應腺病毒轉染;術后12周Ad-ProT+Stress組和Stress組小鼠進行為期兩周的限制性精神應激，6小時/天，5天/周;末次應激結束后（即套管術后14周），所有小鼠均行安樂

8、死，留取組織和血液標本。
　　 第三部分(n=32):為了驗證Ad-ProT+Stress組斑塊破裂和血栓形成的可重復性和穩(wěn)定性，以及ACS患者臨床常用的雙聯(lián)抗血小板治療是否適于本模型，32只ApoE-/-小鼠隨機分為以下兩組:
　　 (1)Ad-ProT+Stress組(n=16):干預措施與第二部分Ad-ProT+Stress組同;
　　 (2)抗血小板藥物治療組（anti-platelet組，n=16）:腺

9、病毒轉染和精神應激方法同Ad-ProT+Stress組，并于術后11周—14周給予抗血小板藥物（阿司匹林5mg/kg/d，氯吡格雷25mg/kg/d）灌胃。
　　 套管術后14周所有小鼠均進行安樂死，留取組織和血液標本。
　　 第四部分(n=14):為觀察相同程度的凝血酶原過表達聯(lián)合精神應激是否可以誘發(fā)較小負荷頸動脈斑塊出現(xiàn)斑塊斑塊破裂和血栓形成，14只ApoE-/-小鼠于套管術后6周進行尾靜脈注射轉染Ad-ProT，術

10、后7周開始進行限制性精神應激6小時/天，5天/周，共兩周。術后9周，所有小鼠行安樂死，留取組織和血液標本。
　　 3、血液凝血狀態(tài)評價:
　　 (1)采用全自動血凝儀檢測血漿中凝血酶原活性;
　　 (2)采用凝血酶生成試驗檢測血液凝血水平;
　　 (3)分別以CD41和CD62P作為血小板和活化血小板的標記物，采用流式細胞術檢測血小板活化水平。
　　 4、病理學檢測:頸動脈斑塊連續(xù)切片，并進行病理

11、學染色、免疫組化/熒光染色等，觀察以下指標:
　　 (1)腺病毒轉染效率;
　　 (2)頸動脈斑塊破裂、血栓形成、斑塊內(nèi)出血、基底膜斷裂等發(fā)生情況;
　　 (3)斑塊負荷;
　　 (4)斑塊內(nèi)脂質、膠原纖維、平滑肌細胞和巨噬細胞含量;
　　 (5)斑塊內(nèi)炎癥因子（IL-1β、IL-6、MCP-1）表達水平;
　　 (6)斑塊內(nèi)細胞凋亡程度。
　　 5、分子生物學檢測:
　　

12、 (1)對頸動脈斑塊組織進行小鼠動脈粥樣硬化PCR芯片檢測，觀察各組小鼠與動脈粥樣硬化相關84個基因的表達水平變化;
　　 (2)Westernblot法檢測頸動脈斑塊組織中caspase3、cleavedcaspase3、(pro-)MMP-2、(pro-)MMP-9表達水平。
　　 研究結果：
　　 1、血液凝血水平
　　 Ad-ProT轉染4天后，小鼠血漿中凝血酶原活性顯著高于轉染前，轉染15天后達

13、到高峰，轉染22天后上述各指標仍高于轉染前。
　　 2、斑塊破裂和血栓形成及斑塊內(nèi)出血發(fā)生情況
　　 Ad-ProT+Stress組14只小鼠中10只(71％)出現(xiàn)頸動脈斑塊破裂，并形成富含血小板和纖維素的附壁動脈血栓，其中5例同時出現(xiàn)新、舊血栓，提示斑塊不止一次發(fā)生破裂。另外，4只(28.6％)小鼠頸動脈斑塊出現(xiàn)較大范圍斑塊內(nèi)出血，其中3例與斑塊破裂和血栓形成合并存在。
　　 其他三組斑塊急性事件發(fā)生率遠低于A

14、d-ProT+Stress組小鼠。Unstress組14％(2/14)出現(xiàn)頸動脈斑塊埋藏纖維帽，未血栓形成。Stress組雖有71％(10/14)頸動脈斑塊發(fā)生破裂，包括14％(2/14)新鮮斑塊破裂和57％(8/14)埋藏纖維帽，但僅14％(2/14)形成血栓。Ad-ProT組21％頸動脈斑塊(3/14)出現(xiàn)斑塊破裂和血栓形成，其中14％(2/14)合并出現(xiàn)斑塊內(nèi)出血。
　　 3、斑塊破裂和血栓形成與斑塊易損性
　　

15、與Unstress組相比，Ad-ProT+Stress組和Stress組小鼠頸動脈斑塊內(nèi)膠原纖維含量顯著降低，炎癥因子MCP-1、IL-1β、IL-6等表達顯著增多，MMP-2、MMP-9原型及活化形式表達水平均明顯增加。與Unstress組相比，Ad-ProT組小鼠頸動脈斑塊內(nèi)MMP-2、MMP-9和炎癥因子MCP-1、IL-6表達水平也呈一定程度增高，膠原纖維含量略低，但變化程度低于Ad-ProT+Stress和Stress兩組。<

16、br>　　 小鼠動脈粥樣硬化PCR芯片結果顯示Ad-ProT+Stress和Stress兩組小鼠頸動脈斑塊組織中AS相關基因表達變化較一致，與Unstress組相比，均有9種炎癥相關因子和1種與脂質代謝相關基因表達上調(diào)，2種抗凋亡基因表達下調(diào)。Ad-ProT組小鼠頸動脈斑塊組織中5種炎癥相關因子mRNA表達水平亦高于Unstress組，但上調(diào)幅度低于Ad-ProT+Stress和Stress兩組小鼠。
　　 與Unstress

17、組相比，Ad-ProT+Stress和Stress組小鼠頸動脈斑塊內(nèi)細胞凋亡比例顯著升高（53.8±3.8％和51.2±3.8％vs.23.9±4.2％，P＜0.001），Caspase3活化增多。Ad-ProT組在斑塊內(nèi)凋亡細胞比例以及Caspase3活化與Unstress組相比均無統(tǒng)計學差異。
　　 4、Ad-ProT+Stress組小鼠斑塊破裂和血栓形成模型的驗證
　　 采用相同干預措施重復Ad-ProT+Stre

18、s組，結果顯示頸動脈斑塊破裂和血栓形成發(fā)生率為69％(11/16)，其中31％(5/16)同時合并新、舊血栓存在。另外，25％(4/16)頸動脈斑塊出現(xiàn)較大范圍斑塊內(nèi)出血，且均合并存在斑塊破裂和血栓形成。這些結果與前次Ad-ProT+Stress組結果相近，提示該模型斑塊破裂和血栓形成重復性和穩(wěn)定性均較好。
　　 與Ad-ProT+Stress組相比，抗血小板藥物治療血小板活化水平顯著降低(P＜0.05)，斑塊破裂后血栓形成發(fā)生

19、率亦顯著降低（70％vs.19％，P＜0.005）。兩組頸動脈斑塊負荷、斑塊內(nèi)平滑肌細胞、巨噬細胞、脂質和膠原含量以及炎癥因子表達水平等指標并無顯著差異。
　　 5、斑塊破裂和血栓形成與斑塊負荷的關系
　　 雖然給予相同強度精神應激和凝血酶原過表達，但斑塊負荷較小的Ad-ProT+Stress-9wks組斑塊破裂、血栓形成發(fā)生率僅為14％(2/14)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，雖然Ad-ProT+Stress-9wks組頸動脈斑塊

20、負荷明顯小于Ad-ProT+Stress-14wks組，但發(fā)生斑塊破裂和血栓形成的頸動脈斑塊的負荷與Ad-ProT+Stress-14wks組相比并無明顯差別;統(tǒng)計分析該研究中所有破裂斑塊的負荷，發(fā)現(xiàn)79％發(fā)生于橫斷面面積狹窄率為75％-100％的病變，21％發(fā)生于面積狹窄率為50％-74％的斑塊，在面積狹窄率＜50％的病變中未發(fā)現(xiàn)斑塊破裂和血栓形成跡象，提示斑塊急性事件與斑塊負荷間存在一定的相關關系。
　　 結論：
　　

21、 1、通過在已形成成熟頸動脈斑塊的ApoE-/-小鼠體內(nèi)過表達凝血酶原增加血液致栓性，并以精神應激為斑塊破裂觸發(fā)因素，可成功構建具有高斑塊破裂率、高血栓形成率的“雙高”AS動物模型;
　　 2、該動物模型中斑塊破裂和血栓形成的發(fā)生與斑塊不穩(wěn)定性增加、斑塊負荷較大以及血液致栓狀態(tài)有關;
　　 3、斑塊不穩(wěn)定性增加可能與斑塊內(nèi)細胞凋亡增多、炎癥反應加重、MMPs活化增強有關;
　　 4、該模型易重復，較穩(wěn)定，與人類