小G蛋白Rab5對表達(dá)在HEK293細(xì)胞上大電導(dǎo)鈣激活鉀通道的影響.pdf

1、目的：眾所周知，大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BKCa）可以將人體不同組織細(xì)胞內(nèi)的鈣離子信號和細(xì)胞興奮性相聯(lián)系，這種生理功能在調(diào)節(jié)人體的血液流動、尿液排出、免疫應(yīng)答等多種生命活動中具有極其重要的作用。BKCa通道是人體血管平滑肌細(xì)胞膜上的主要離子通道，在血管舒縮功能調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。BKCa通道由4個α亞基與具有調(diào)節(jié)功能的β亞基組成，其中β亞單位是BKCa通道在人體血管平滑肌細(xì)胞上最為重要的輔助亞單位，是通道蛋白執(zhí)行其生理功能的關(guān)鍵性因素

2、之一，如果β亞單位出現(xiàn)生理功能異常，就可能引起多種心血管疾?。ㄈ绺哐獕旱龋?。BKCa通道蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成、高爾基體加工之后，還需經(jīng)過一系列復(fù)雜的轉(zhuǎn)運機制并組裝到質(zhì)膜上，才能發(fā)揮其生理功能。小G蛋白家族成員中的Rab在質(zhì)膜內(nèi)側(cè)及多種胞內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)中存在，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、囊泡轉(zhuǎn)運和離子通道活動等生理功能。結(jié)合既往的研究，提示Rab和BKCa通道蛋白可能存在某種相互聯(lián)系，但是全面深入的研究甚少，為了更好的研究BKCa通道蛋白的調(diào)節(jié)機制，我

3、們選取了Rab5作為研究對象，展開實驗，探討小G蛋白Rab5對HEK293細(xì)胞大電導(dǎo)鈣激活鉀(BKCa)通道的影響。
　　方法：根據(jù)以往的研究經(jīng)驗，我們選用的實驗細(xì)胞為人胚腎293細(xì)胞系。首先將含有人血管平滑肌BKca通道?亞單位(hSlo1)的Flag和GFP雙標(biāo)記表達(dá)質(zhì)粒（Flag-hSlo1-GFP）使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和不同形式的Rab5表達(dá)質(zhì)粒（野生型WT，顯性負(fù)向型DN，持續(xù)激活型CA）轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞，使用膜

4、片鉗技術(shù)、Western blotting和流式細(xì)胞術(shù)，研究小G蛋白Rab5對BKCa通道的細(xì)胞宏觀電流、BKCa通道的膜蛋白在HEK293細(xì)胞膜上表達(dá)水平和BKCa通道的轉(zhuǎn)運蛋白的影響。
　　結(jié)果：實驗結(jié)果表明，表達(dá)在HEK293細(xì)胞上的大電導(dǎo)鈣激活鉀(BKCa)通道和天然BKCa通道幾乎具有相似的電生理學(xué)特性，膜片鉗實驗表明在全細(xì)胞構(gòu)型下，當(dāng)細(xì)胞膜電位(Vm)達(dá)到+60mV時，Rab5 WT和Rab5 CA可以分別增加BKca

5、通道宏觀電流密度由49.19±3.76pA/pF增加到68.38±5.33pA/pF(P<0.05,n=6)和87.16±3.79pA/pF(P<0.05,n=6)。而Rab5DN減少BKca通道宏觀電流密度，由49.19±3.76pA/pF減少到34.68±3.37pA/pF(P<0.05,n=6)。Western blotting實驗結(jié)果顯示，Rab5 WT和Rab5 CA增加BKCa通道蛋白在HEK293細(xì)胞膜上的表達(dá)水平,相對表

6、達(dá)量分別是對照組的1.24±0.08倍（Rab5 WT）和1.42±0.13倍（Rab5 CA）（P<0.05）,而Rab5 DN減少BKCa通道蛋白在HEK293細(xì)胞膜上的表達(dá)水平，相對表達(dá)量是對照組的0.73±0.11（P<0.05），兩者都具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。流式細(xì)胞術(shù)實驗結(jié)果顯示Rab5 WT和Rab5 CA可以明顯增加Flag+/GFP+比值，而Rab5 DN明顯減小Flag+/GFP+比值（P<0.05或0.01）,這表明