環(huán)境內(nèi)毒素應(yīng)答新分子的表達(dá)分析及對(duì)HEK293細(xì)胞生長(zhǎng)及周期的影響.pdf

1、【背景】?jī)?nèi)毒素（Endotoxin）是革蘭氏陰性細(xì)菌（Gram-negative bacterium，GNB）細(xì)胞壁的主要成分，它不僅是決定GNB 感染（如膿毒癥和感染性休克）的主要致病因子，而且與人類其他許多疾病關(guān)系密切，是一種危及人類健康乃至生命的最為重要的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）。 脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是內(nèi)

2、毒素的有效成分，由親水性的多糖（O-特異性多糖，核心多糖）和疏水性的類脂A（Lipid A）組成。其中Lipid A 與LPS的毒性相關(guān)。LPS 在細(xì)菌死亡破裂或人工方法裂解后釋放，一旦進(jìn)入人或其他敏感動(dòng)物體內(nèi)，將對(duì)宿主各系統(tǒng)、器官均可產(chǎn)生廣泛的影響。 內(nèi)毒素的致病機(jī)制其主要是LPS 通過(guò)持續(xù)刺激機(jī)體單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，使之產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子（如TNF-α、IL-6 和IL-12 等）、活性氧、溶酶體酶和NO 等活性物質(zhì)，從而引起

3、細(xì)胞損傷和凋亡，最終導(dǎo)致失控性炎性反應(yīng)，并伴有較高的機(jī)體死亡率。 盡管對(duì)內(nèi)毒素致炎反應(yīng)的分子機(jī)制已經(jīng)有很多研究，但仍存在著許多未解之謎。因此尋找新的內(nèi)毒素應(yīng)答分子，研究相關(guān)分子的功能，將會(huì)有助于我們更加深入的了解內(nèi)毒素的作用機(jī)制。 環(huán)境內(nèi)毒素應(yīng)答新分子，又名lrp，是一種LPS應(yīng)答基因，系本課題采用基于PCR的改良消減雜交技術(shù)，構(gòu)建LPS刺激后人牙髓細(xì)胞差異表達(dá)基因文庫(kù)，從中篩選出的新基因（GenBank錄入號(hào)為AF14

4、3740），當(dāng)時(shí)得到的只是基因編碼N-端186個(gè)氨基酸的部分。 隨后全長(zhǎng)cDNA也被克隆并錄入GenBank（錄入號(hào)NM018360）。生物信息學(xué)分析表明，全長(zhǎng)人lrp（hlrp）基因的開放讀框?yàn)?584 bp，編碼528個(gè)氨基酸，編碼序列中包含2個(gè)相互重疊的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和1個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)。該分子可能具有重要的作用。 在即往研究中，本課題組成功克隆了全長(zhǎng)lrp基因后并制備了兔抗lrp多克隆抗體、并進(jìn)行了Hlrp

5、蛋白在細(xì)胞中的定位等相關(guān)研究。但對(duì)其功能及其表達(dá)機(jī)制的研究尚未進(jìn)行。因此本實(shí)驗(yàn)將對(duì)全長(zhǎng)hlrp分子在組織和細(xì)胞的表達(dá)譜進(jìn)行初步分析并對(duì)其功能做初步的探索。 【目的】 1. 觀察Hlrp 蛋白在多種正常組織的表達(dá)及分布； 2. 觀察分析hlrp 分子在不同細(xì)胞的表達(dá)情況并進(jìn)行相對(duì)定量； 3. 觀察高表達(dá)hlrp 分子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的影響； 4. 觀察針對(duì)hlrp 分子的特異性RNA 干涉對(duì)HE

6、K293 的生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的影響； 5. 研究相關(guān)脂多糖信號(hào)傳導(dǎo)分子在高表達(dá)hlrp 的HEK293 細(xì)胞與正常HEK293 細(xì)胞的差異表達(dá)。 【方法】 1. 應(yīng)用正常人體組織芯片（48 例不同部位），進(jìn)行Hlrp 免疫組織化學(xué)染色; 2. 采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色，在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察HLrp 蛋白在不同細(xì)胞系HepG2，HeLa，PDC 和HEK293 中的表達(dá)情況；利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR

7、方法，量化比較hlrp 基因在不同細(xì)胞系中的表達(dá)； 3. 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-hlrp 到HEK293 細(xì)胞，利用Western Blot 技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Hlrp 蛋白的表達(dá)變化，利用MTT 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖活性，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期的變化； 4. 針對(duì)Hlrp 分子，實(shí)施特異性的RNA 干涉，利用Western Blot 技術(shù)檢測(cè)干涉后Hlrp 蛋白的變化，利用MTT 法檢測(cè)干涉后細(xì)胞增殖活性

8、，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)干涉后細(xì)胞周期的變化； 5. 應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)Hlrp 的HEK293 細(xì)胞與正常HEK293 細(xì)胞中LPS信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)差異性。 【結(jié)果】 1. Hlrp 蛋白分布于絕大多數(shù)所檢測(cè)的人體正常組織； 2. 運(yùn)用激光掃描共聚焦顯微鏡可以觀察到Hlrp 蛋白在所用4 種細(xì)胞系中均有表達(dá)。實(shí)時(shí)定量RT-RCR 結(jié)果表明，hlrp 分子在HEK293 細(xì)胞株和PDC 細(xì)胞株中

9、高表達(dá)，并且在PDC 細(xì)胞株表達(dá)高于HEK293 細(xì)胞株。在HepG2，HeLa 細(xì)胞株未檢測(cè)到表達(dá)； 3. 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）-hlrp 到HEK293 細(xì)胞后，MTT 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖活性與對(duì)照組相比明顯降低，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組G1 期部分阻滯； 4. 特異性RNA 干涉后HEK293 細(xì)胞Hlrp 蛋白水平表達(dá)明顯下調(diào)，干涉后細(xì)胞的增殖活性與對(duì)照組相比明顯增加，流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)組G1 期

10、比例期減少； 5. 基因芯片檢測(cè)結(jié)果表明：①M(fèi)APKs 級(jí)聯(lián)通路中，差異表達(dá)的基因有12 種，其中上調(diào)的有6 種，下調(diào)的有6 種； MAPKs ②信號(hào)通路中差異表達(dá)的基因有38種；其中上調(diào)14 種，下調(diào)24 種；③ TNF-α/NF-κB 相關(guān)通路中差異表達(dá)的基因有58 種，其中上調(diào)29 種，下調(diào)29 種。 【結(jié)論】 1. Hlrp 在多種人體正常組織及培養(yǎng)細(xì)胞系中有表達(dá)，可為進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)

11、； 2. 獲得穩(wěn)定高表達(dá)hlrp 的HEK293 細(xì)胞模型。為今后此類研究提供了理想的細(xì)胞平臺(tái)。 3. 獲得特異干涉hlrp 的HEK293 細(xì)胞模型，此模型可供今后進(jìn)一步研究； 4. 穩(wěn)定高表達(dá)的hlrp 可產(chǎn)生HEK293 細(xì)胞G1 期部分阻滯；而RNA 干涉之后G1期所占比例減少，表明hlrp 有可能參與了細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)； 5. 篩選出高表達(dá)hlrp 的HEK293 細(xì)胞LPS 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路差異表達(dá)