橘核檸檬苦素類化合物生物合成功能基因的克隆、表達及成分積累研究.pdf

1、橘核的主要藥理活性成分為檸檬苦素類化合物。課題從檸檬苦素類化合物生物合成路徑的中、下游階段選擇了三個功能基因開展深入研究——克隆、分析、表達了角鯊烯合成酶基因、角鯊烯環(huán)氧酶基因、檸檬苦素葡萄糖基轉移酶基因，分析了檸檬苦素類化合物成分在莖（韌皮部）、葉片、果皮、種子（胚）等器官的積累規(guī)律，為檸檬苦素類化合物生物合成機制和轉運規(guī)律的研究奠定了基礎。
　　1.樣本總RNA提取、功能基因克隆和生物信息學分析
　　采用Omega試劑盒

2、用于樣本總RNA提取并進行凝膠電泳檢測，對純度符合要求的RNA逆轉錄。根據(jù)同源基因參考序列設計特異性引物，考察PCR條件，得到PCR產(chǎn)物，并對PCR產(chǎn)物進行測序，從大紅袍Citrus reticulata‘Dahongpao’成熟種子（胚）中成功克隆獲得了ss、se、lgt基因序列。
　　對關鍵功能基因序列進行比對和進化分析，并對其所編碼的蛋白質進行序列比對，一級、二級、三級結構預測，開放閱讀框識別、疏水性圖譜預測，信號肽切割位點

3、，對檸檬苦素類化合物生物合成路徑中功能基因和關鍵酶進行進一步的了解和分析，清楚其結構和特點。
　　2.檸檬苦素類化合物生物合成過程中功能基因的表達
　　建立了大紅袍樣本的real-time PCR表達方法，得到了ss、se、lgt三個基因在莖（韌皮部）、葉、果皮、種子（胚）四個不同器官的基因相對表達量。
　　三個基因在種子（胚）中的主要表達趨勢為ss＞se＞lgt；三個基因在同一器官中的表達變化趨勢基本相同；四個不同器

4、官中主要基因表達變化時期為種子成熟期，種子形態(tài)建成末期和脫水期基因表達變化程度較小。
　　繁殖器官種子（胚）和果皮中基因表達情況基本相似，均為成熟期三個基因表達先上升后下降，存在一個最高表達時期，形態(tài)建成末期和脫水期三個基因表達量較低；而營養(yǎng)器官莖（韌皮部）和葉片中基因表達情況基本類似，均為形態(tài)建成末期三個基因表達先下降，再上升至最高值，存在一個高表達階段，成熟期三個基因表達上升、下降再上升至次高值，脫水期三個基因的表達較低。

5、r>　　3.有效成分在各器官積累規(guī)律研究
　　采用UPLC法對不同時期所收集樣本中的檸檬苦素、諾米林、黃柏酮進行了含量測定，對其積累和轉運規(guī)律進行了初步研究。
　　檸檬苦素類成分在種子（胚）中分三個階段逐漸積累，形態(tài)建成末期先下降再上升至第一個次高值，成熟期先上升至第二個次高值后下降，脫水期快速積累達到最高值。檸檬苦素類化合物在種子（胚）中的含量較高，其含量在干燥期達到最高，推測種子（胚）可能是檸檬苦素類化合物的最終儲存位置

6、，果實完全成熟（12月中旬）前后為橘核藥材的最佳采收期之后有效成分含量急劇下降。
　　三個成分在四個不同器官中變化趨勢基本一致，且大小次序均為檸檬苦素＞諾米林＞黃柏酮。在130天果實和種子發(fā)育成熟階段，繁殖器官（種子）中有效成分總含量為升高趨勢，營養(yǎng)器官（莖、葉片）中有效成分總含量變化不明顯。推測有效成分可能是通過營養(yǎng)器官不斷向繁殖器官轉運，并在繁殖器官中積累。
　　4.基因表達量與成分積累的灰色關聯(lián)度分析
　　采用D

7、PS軟件對基因表達量和有效成分之間的關聯(lián)性進行分析，種子（胚）中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮各個有效成分含量積累貢獻最大的均為lgt基因，其次為ss和se基因。lgt主要是在檸檬苦素類化合物生物合成的下游階段，催化檸檬苦素類化合物轉化為相應的葡萄糖苷過程中發(fā)揮作用。
　　莖（韌皮部）、葉片中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮各個有效成分含量積累貢獻值最大的均為ss基因，其次為se和lgt基因。ss和se主要在檸檬苦素類化合物生物合成中游階段即角