p38MAPK在熱壓所致生精細(xì)胞凋亡中的作用及L-NAME對(duì)它的影響.pdf

1、　　目的:探討p38MAPK通路在熱壓誘導(dǎo)的生精細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用。研究L-NAME對(duì)隱睪生精細(xì)胞凋亡過(guò)程中磷酸化p38MAPK表達(dá)的抑制作用，揭示生精細(xì)胞凋亡過(guò)程中NOS/NO通路與p38MAPK通路之間的關(guān)系。　　方法:將42日齡雄性SD大鼠建立單側(cè)隱睪模型，24只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、隱睪組、隱睪+溶媒組、隱睪+p38MAPK抑制劑(SB203580)組，每組6只大鼠，模型建立按文獻(xiàn)操作[9]，戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔

2、內(nèi)注射麻醉，下腹正中切口，隱睪組大鼠切斷右側(cè)睪丸引帶，用5-0尼龍線將右側(cè)睪丸固定于腹后壁后關(guān)腹，術(shù)后未注射任何藥物；隱睪+溶媒組及隱睪+SB203580組大鼠右側(cè)睪丸手術(shù)處理方法同隱睪組大鼠，術(shù)后分別腹腔內(nèi)注射溶媒或SB203580，每天一次，定時(shí)定量(100μg/kg)，假手術(shù)組將右側(cè)睪丸切斷引帶后還納入陰囊關(guān)腹。術(shù)后第七天處死，留取各組大鼠雙側(cè)睪丸稱濕重，常規(guī)組織學(xué)切片光鏡觀察各組右側(cè)睪丸生精上皮形態(tài)；TUNEL原位末端標(biāo)記法結(jié)合

3、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)各組右側(cè)睪丸生精細(xì)胞凋亡；免疫組化和Westernblot觀察各組右側(cè)睪丸磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)的變化。將42日齡雄性SD大鼠建立單側(cè)隱睪模型，48只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、隱睪組、隱睪+生理鹽水組、隱睪+NOS抑制劑(L-NAME)組，每組12只大鼠，戊巴比妥鈉(30mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，下腹正中切口，隱睪組大鼠切斷右側(cè)睪丸引帶，用5-0尼龍線將右側(cè)睪丸固定于腹后壁后關(guān)腹，術(shù)后未注射任何藥物；隱睪+生

4、理鹽水組及隱睪+L-NAME組大鼠右側(cè)睪丸手術(shù)處理方法同隱睪組大鼠，術(shù)后分別腹腔內(nèi)注射生理鹽水或L-NAME，每天一次，定時(shí)定量(50mg/kg)，假手術(shù)組將右側(cè)睪丸切斷引帶后還納入陰囊關(guān)腹。術(shù)后第7天脫頸椎處死大鼠。留取各組大鼠雙側(cè)睪丸稱濕重；硝酸還原酶法測(cè)定各組右側(cè)睪丸組織NO含量，化學(xué)比色法測(cè)定各組右側(cè)睪丸組織NOS活性；常規(guī)組織學(xué)切片觀察各組右側(cè)睪丸生精上皮形態(tài)；TUNEL原位末端標(biāo)記法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)各組右側(cè)睪丸生

5、精細(xì)胞凋亡；免疫組化檢測(cè)各組右側(cè)睪丸iNOS和磷酸化p38MAPK表達(dá)變化，Westernblot檢測(cè)各組右側(cè)睪丸磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)量的變化?！　〗Y(jié)果:各組大鼠左側(cè)睪丸及假手術(shù)組左側(cè)與右側(cè)睪丸之間重量無(wú)明顯差異，其余各組右側(cè)隱睪均輕于左側(cè)睪丸重量，但隱睪+SB203580組隱睪重量明顯大于隱睪組及隱睪+溶媒組；隱睪組及隱睪+溶媒組之間各檢測(cè)指標(biāo)差異無(wú)顯著性意義；凋亡指數(shù)(AI)在隱睪組及隱睪+溶媒組最高，隱睪+SB20358

6、0組次之，假手術(shù)組最低，差別均有顯著性意義；隱睪組及隱睪+溶媒組的生精細(xì)胞凋亡率明顯高于假手術(shù)組和隱睪+SB203580組。免疫組化顯示假手術(shù)組和隱睪+SB203580組的睪丸生精上皮內(nèi)無(wú)磷酸化p38MAPK表達(dá)，其余兩組隱睪生精上皮內(nèi)均有較強(qiáng)的磷酸化p38MAPK表達(dá)。Westernblot顯示，四組均有磷酸化p38MAPK的條帶，隱睪組和隱睪+溶媒組表達(dá)最強(qiáng)，隱睪+SB203580組次之，假手術(shù)組最弱。各組大鼠左側(cè)睪丸及假手術(shù)組左側(cè)

7、與右側(cè)睪丸之間重量無(wú)明顯差異，其余各組右側(cè)隱睪均輕于左側(cè)睪丸重量，但隱睪+L-NAME組隱睪重量明顯大于隱睪組及隱睪+生理鹽水組；隱睪組及隱睪+生理鹽水組之間各檢測(cè)指標(biāo)差異無(wú)顯著性意義；凋亡指數(shù)(AI)在隱睪組及隱睪+生理鹽水組最高，隱睪+L-NAME組次之，假手術(shù)組最低，差別均有顯著性意義；隱睪組及隱睪+生理鹽水組的生精細(xì)胞凋亡率、睪丸組織NO含量和NOS活性均明顯高于假手術(shù)組和隱睪+L-NAME組。免疫組化顯示假手術(shù)組睪丸生精上皮內(nèi)

8、無(wú)iNOS表達(dá)，而其他三組的睪丸生精上皮內(nèi)均可見(jiàn)到iNOS的表達(dá)，且多見(jiàn)于凋亡的生精細(xì)胞；免疫組化顯示假手術(shù)組和隱睪+L-NAME組的睪丸生精上皮內(nèi)無(wú)磷酸化p38MAPK表達(dá)，其余兩組隱睪生精上皮內(nèi)均有較強(qiáng)的磷酸化p38MAPK表達(dá)。Westernblot顯示，四組均有磷酸化p38MAPK的條帶，而隱睪組和隱睪+生理鹽水組表達(dá)最強(qiáng)，隱睪+L-NAME組次之，假手術(shù)組最弱?！　〗Y(jié)論1.SB203580能抑制熱壓誘導(dǎo)的生精細(xì)胞凋亡。2.熱