芹菜素對(duì)SW620細(xì)胞葡萄糖吸收及多胺代謝的影響.pdf

1、目的:
　　芹菜素（apigenin，API）屬于黃酮類。具有抑制致癌物質(zhì)的致癌活性，芹菜素主要存在于瑞香科、馬鞭草科、卷柏科植物中，如芫花，卷柏中含量較大。與其他黃酮類物質(zhì)（槲皮素、山奈黃酮）相比具有低毒、無誘變性等特點(diǎn)。結(jié)腸癌(cancer of colon)是西歐、北美等發(fā)達(dá)國家最常見的惡性腫瘤，也是我國九大常見惡性腫瘤之一。在我國，因結(jié)腸癌死亡者，男性居惡性腫瘤死亡的第5位，女性居第6位。至今5年生存率仍徘徊于50％，有效

2、的綜合治療或適當(dāng)?shù)妮o助放療、化療是臨床日益重視的方面，但至今仍有爭議，未能見到令人振奮的結(jié)果。近年來眾多學(xué)者努力尋求中西醫(yī)結(jié)合治療方法來提高患者的五年生存率。多胺有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長的作用，對(duì)于膜的正常維持也起著重要的作用，它們帶有正電荷的氨基使它們和帶有負(fù)電的磷酸基的DNA和RNA結(jié)合，促進(jìn)植物細(xì)胞以及動(dòng)物細(xì)胞中DNA的轉(zhuǎn)錄和RNA的翻譯;它們能和膜上的蛋白質(zhì)或磷脂結(jié)合，使膜保持其穩(wěn)定性。本課題以結(jié)腸癌細(xì)胞SW620為模型，研究芹菜素抑

3、制SW620細(xì)胞多胺代謝以及攝取葡萄糖能力的作用，為的預(yù)防和治療提供新的思路。
　　方法:結(jié)腸癌
　　1細(xì)胞培養(yǎng)
　　按常規(guī)方法培養(yǎng)SW620細(xì)胞株培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基+10％ FBS+1％青鏈霉素雙抗，于5％（ψ）CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。
　　2對(duì)SW620細(xì)胞增殖的影響
　　以SW620細(xì)胞為研究對(duì)象，實(shí)驗(yàn)用10～80μmol·L-1不同濃度芹菜素作用于細(xì)胞，2.5 mmol·L-1的二

4、氟甲基鳥氨酸(DFMO)作為陽性對(duì)照藥，培養(yǎng)24，48，72 hr后，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制情況;同時(shí)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　3對(duì)SW620細(xì)胞SGLT1、GLUT1表達(dá)及葡萄糖攝取的影響
　　Real-Time PCR和Western blot檢測(cè)不同濃度的芹菜素給藥后SW620細(xì)胞SGLT1及GLUT1的mRNA及蛋白表達(dá)水平，葡萄糖測(cè)定試劑盒檢測(cè)SW620細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取作用的影響。
　　4

5、對(duì)SW620細(xì)胞多胺含量的影響
　　柱前衍生—高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)不同濃度的芹菜素對(duì)細(xì)胞內(nèi)多胺含量的影響。
　　5對(duì)SW620細(xì)胞ODC/SSAT表達(dá)的影響
　　Real-Time PCR和Western blot檢測(cè)不同濃度的芹菜素給藥后SW620細(xì)胞ODC及SSAT的mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　6對(duì)SW620細(xì)胞活性氧含量及凋亡的影響
　　流式細(xì)胞儀(Flow Cytometer，F(xiàn)CM)檢

6、測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧相對(duì)水平及細(xì)胞凋亡率，Hoechst33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果:
　　1對(duì)SW620細(xì)胞增殖的抑制作用
　　不同濃度的芹菜素處理SW620細(xì)胞后，細(xì)胞生長受到不同程度的抑制，其抑制作用呈時(shí)間和濃度依賴性，且優(yōu)于DFMO（2.5mmol·L-1）組，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組SW620細(xì)胞呈短梭形，細(xì)胞透明，折光性較好

7、，胞漿豐富透亮，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞密度較大，極少見懸浮的死細(xì)胞及細(xì)胞碎片。芹菜素作用48 hr后觀察，大體可見細(xì)胞密度明顯減少，細(xì)胞內(nèi)顆粒感增強(qiáng)，胞體變長，細(xì)胞間隙逐漸增寬，細(xì)胞界限模糊，胞漿減少，細(xì)胞脫落呈懸浮狀，可見細(xì)胞碎片，存活細(xì)胞減少。
　　2對(duì)SW620細(xì)胞SGLT1、GLUT1表達(dá)及葡萄糖攝取的影響
　　與對(duì)照組比較，芹菜素作用于SW620細(xì)胞24，48，72h后，SW620細(xì)胞的葡萄糖消耗量明顯減少(P＜0.

8、05），當(dāng)同一芹菜素濃度作用時(shí)間逐漸延長或同一作用時(shí)間芹菜素濃度逐漸升高時(shí)，其抑制SW620細(xì)胞攝取葡萄糖的作用逐漸增強(qiáng)，呈濃度和時(shí)間依賴性。而2.5mM的DFMO給藥組對(duì)SW620細(xì)胞葡萄糖消耗有一定的影響，未見優(yōu)于芹菜素。與對(duì)照組比較，GLUT1和SGLT1蛋白及mRNA隨著芹菜素濃度的升高表達(dá)減少。
　　3對(duì)SW620細(xì)胞多胺含量的影響
　　與對(duì)照組相比，芹菜素作用于SW620細(xì)胞48hr后，細(xì)胞內(nèi)的精胺含量明顯減少(

9、P＜0.01，P＜0.05)，腐胺含量明顯增加(P＜0.01，P＜0.05)，總多胺含量呈現(xiàn)濃度依賴性的減少。而2.5mM的DFMO給藥組作用于SW620細(xì)胞后，腐胺、精胺、精脒含量均有所減少(P＜0.01）。當(dāng)二者聯(lián)合使用時(shí)，總多胺含量呈現(xiàn)出明顯的減少(P＜0.01)。
　　4對(duì)SW620細(xì)胞ODC/SSAT表達(dá)的影響
　　與對(duì)照組相比，SSAT的蛋白及mRNA隨著芹菜素濃度的升高表達(dá)上調(diào)，而ODC的蛋白及mRNA水平與對(duì)

10、照組并無顯著性差異。表明芹菜素可能通過促進(jìn)SSAT的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)促進(jìn)多胺代謝的功能，這與HPLC檢測(cè)多胺含量變化的結(jié)果也是一致的。
　　5對(duì)SW620細(xì)胞ROS含量及凋亡的影響
　　FCM結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，SW620細(xì)胞內(nèi)的ROS含量及細(xì)胞凋亡率隨芹菜素濃度的升高而增加。芹菜素作用后，晚期凋亡和壞死的細(xì)胞均明顯多于對(duì)照組，且凋亡細(xì)胞數(shù)目隨芹菜素的濃度增高而增加，呈現(xiàn)濃度依賴性。Hoechst33258染色后可見，對(duì)照組細(xì)

11、胞核大，核內(nèi)的熒光染色淺，且亮度均一，呈淡藍(lán)色。不同濃度的芹菜素處理后可見細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，細(xì)胞數(shù)目隨芹菜素濃度增大而逐漸減少，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，包括凋亡細(xì)胞核固縮，細(xì)胞核碎裂成塊狀、著色深而呈亮藍(lán)色，生成凋亡小體。
　　結(jié)論:
　　1.對(duì)SW620細(xì)胞增殖的抑制作用
　　芹菜素能抑制對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且具有濃度和時(shí)間依賴性。芹菜素作用24、48、72hr檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著芹菜素濃度增加，

12、對(duì)細(xì)胞的抑制作用顯著增強(qiáng)，10μM的芹菜素作用48hr時(shí)，SW620細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，表明10μM可能是芹菜素在體外發(fā)揮藥效的最低濃度。這有助于為芹菜素抗結(jié)腸癌的進(jìn)一步研究及其臨床用藥提供藥效時(shí)間的依據(jù)。
　　2.對(duì)SW620細(xì)胞SGLT1通路及葡萄糖攝取的影響
　　葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)及鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)載體(SGLT1)是目前已知體內(nèi)分布最為廣泛的兩個(gè)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體，其主要參與葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的正常生理過程，

13、腫瘤細(xì)胞攝取葡萄糖增加主要通過增加GLUT1及SGLT1的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，來實(shí)現(xiàn)自身對(duì)能量的高攝取。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)SW620細(xì)胞葡萄糖消耗量，表明芹菜素作用后的SW620細(xì)胞葡萄糖消耗量均明顯減少，且隨著芹菜素濃度增加，其抑制SW620細(xì)胞攝取葡萄糖的作用越明顯，具有劑量依賴性。與此相應(yīng)，芹菜素同時(shí)也下調(diào)SW620細(xì)胞的GLUT1及SGLT1蛋白表達(dá)水平，故我們推測(cè)，芹菜素對(duì)SW620細(xì)胞的葡萄糖攝取的影響，可能是與抑制細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)GLUT

14、1及SGLT1蛋白表達(dá)有關(guān)，這也可能是芹菜素抗腫瘤的作用機(jī)制之一。
　　.3對(duì)SW620細(xì)胞多胺含量的影響
　　多胺是一類廣泛分布于組織細(xì)胞內(nèi)的天然小分子脂肪族物質(zhì)，包括腐胺(putrescine，Put)、精脒(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)，其中以精胺的活性及作用最強(qiáng)。多胺對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長，增殖及分化起到了重要的調(diào)控作用，而腫瘤組織中多胺含量遠(yuǎn)高于正常組織。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)SW620細(xì)

15、胞內(nèi)的多胺含量，芹菜素作用后的SW620細(xì)胞精胺及精脒減少，腐胺稍有增多，總多胺含量減少，表明其促進(jìn)了多胺的代謝分解，且隨著芹菜素濃度增加，其促進(jìn)SW620多胺代謝的作用越明顯，具有劑量依賴性。
　　4.對(duì)SW620細(xì)胞ODC/SSAT表達(dá)的影響
　　鳥氨酸脫羧酶(Ornithine decarboxylase，ODC)是多胺合成的限速酶，對(duì)多胺的胞內(nèi)合成起到至關(guān)重要的調(diào)控作用，而精胺/精脒-N1-乙?；D(zhuǎn)移酶(spermi

16、dine/spermineN1-acetyltransferase，SSAT)為多胺分解代謝的限速酶。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)SW620細(xì)胞內(nèi)的ODC及SSAT的蛋白及mRNA的表達(dá)，表明芹菜素作用后的SW620細(xì)胞SSAT蛋白及mRNA表達(dá)上調(diào)，ODC與對(duì)照組并無明顯差異，這與多胺含量改變也表現(xiàn)一致。
　　5.對(duì)SW620細(xì)胞ROS含量及凋亡的影響
　　多胺代謝分解過程中會(huì)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物ROS，ROS的胞內(nèi)積聚會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡熒光染