芹菜素對SW620細胞葡萄糖吸收及多胺代謝的影響.pdf

1、目的:
　　芹菜素（apigenin，API）屬于黃酮類。具有抑制致癌物質的致癌活性，芹菜素主要存在于瑞香科、馬鞭草科、卷柏科植物中，如芫花，卷柏中含量較大。與其他黃酮類物質（槲皮素、山奈黃酮）相比具有低毒、無誘變性等特點。結腸癌(cancer of colon)是西歐、北美等發(fā)達國家最常見的惡性腫瘤，也是我國九大常見惡性腫瘤之一。在我國，因結腸癌死亡者，男性居惡性腫瘤死亡的第5位，女性居第6位。至今5年生存率仍徘徊于50％，有效

2、的綜合治療或適當?shù)妮o助放療、化療是臨床日益重視的方面，但至今仍有爭議，未能見到令人振奮的結果。近年來眾多學者努力尋求中西醫(yī)結合治療方法來提高患者的五年生存率。多胺有促進腫瘤細胞生長的作用，對于膜的正常維持也起著重要的作用，它們帶有正電荷的氨基使它們和帶有負電的磷酸基的DNA和RNA結合，促進植物細胞以及動物細胞中DNA的轉錄和RNA的翻譯;它們能和膜上的蛋白質或磷脂結合，使膜保持其穩(wěn)定性。本課題以結腸癌細胞SW620為模型，研究芹菜素抑

3、制SW620細胞多胺代謝以及攝取葡萄糖能力的作用，為的預防和治療提供新的思路。
　　方法:結腸癌
　　1細胞培養(yǎng)
　　按常規(guī)方法培養(yǎng)SW620細胞株培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基+10％ FBS+1％青鏈霉素雙抗，于5％（ψ）CO2，37℃細胞培養(yǎng)箱內傳代培養(yǎng)。
　　2對SW620細胞增殖的影響
　　以SW620細胞為研究對象，實驗用10～80μmol·L-1不同濃度芹菜素作用于細胞，2.5 mmol·L-1的二

4、氟甲基鳥氨酸(DFMO)作為陽性對照藥，培養(yǎng)24，48，72 hr后，CCK-8法檢測細胞增殖抑制情況;同時，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。
　　3對SW620細胞SGLT1、GLUT1表達及葡萄糖攝取的影響
　　Real-Time PCR和Western blot檢測不同濃度的芹菜素給藥后SW620細胞SGLT1及GLUT1的mRNA及蛋白表達水平，葡萄糖測定試劑盒檢測SW620細胞對葡萄糖攝取作用的影響。
　　4

5、對SW620細胞多胺含量的影響
　　柱前衍生—高效液相色譜法(HPLC)檢測不同濃度的芹菜素對細胞內多胺含量的影響。
　　5對SW620細胞ODC/SSAT表達的影響
　　Real-Time PCR和Western blot檢測不同濃度的芹菜素給藥后SW620細胞ODC及SSAT的mRNA及蛋白表達水平。
　　6對SW620細胞活性氧含量及凋亡的影響
　　流式細胞儀(Flow Cytometer，F(xiàn)CM)檢

6、測細胞內活性氧相對水平及細胞凋亡率，Hoechst33258檢測細胞凋亡形態(tài)學變化。
　　結果:
　　1對SW620細胞增殖的抑制作用
　　不同濃度的芹菜素處理SW620細胞后，細胞生長受到不同程度的抑制，其抑制作用呈時間和濃度依賴性，且優(yōu)于DFMO（2.5mmol·L-1）組，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。細胞培養(yǎng)48 h后在倒置顯微鏡下觀察，正常對照組SW620細胞呈短梭形，細胞透明，折光性較好

7、，胞漿豐富透亮，細胞間連接緊密，細胞密度較大，極少見懸浮的死細胞及細胞碎片。芹菜素作用48 hr后觀察，大體可見細胞密度明顯減少，細胞內顆粒感增強，胞體變長，細胞間隙逐漸增寬，細胞界限模糊，胞漿減少，細胞脫落呈懸浮狀，可見細胞碎片，存活細胞減少。
　　2對SW620細胞SGLT1、GLUT1表達及葡萄糖攝取的影響
　　與對照組比較，芹菜素作用于SW620細胞24，48，72h后，SW620細胞的葡萄糖消耗量明顯減少(P＜0.

8、05），當同一芹菜素濃度作用時間逐漸延長或同一作用時間芹菜素濃度逐漸升高時，其抑制SW620細胞攝取葡萄糖的作用逐漸增強，呈濃度和時間依賴性。而2.5mM的DFMO給藥組對SW620細胞葡萄糖消耗有一定的影響，未見優(yōu)于芹菜素。與對照組比較，GLUT1和SGLT1蛋白及mRNA隨著芹菜素濃度的升高表達減少。
　　3對SW620細胞多胺含量的影響
　　與對照組相比，芹菜素作用于SW620細胞48hr后，細胞內的精胺含量明顯減少(

9、P＜0.01，P＜0.05)，腐胺含量明顯增加(P＜0.01，P＜0.05)，總多胺含量呈現(xiàn)濃度依賴性的減少。而2.5mM的DFMO給藥組作用于SW620細胞后，腐胺、精胺、精脒含量均有所減少(P＜0.01）。當二者聯(lián)合使用時，總多胺含量呈現(xiàn)出明顯的減少(P＜0.01)。
　　4對SW620細胞ODC/SSAT表達的影響
　　與對照組相比，SSAT的蛋白及mRNA隨著芹菜素濃度的升高表達上調，而ODC的蛋白及mRNA水平與對

10、照組并無顯著性差異。表明芹菜素可能通過促進SSAT的表達來實現(xiàn)促進多胺代謝的功能，這與HPLC檢測多胺含量變化的結果也是一致的。
　　5對SW620細胞ROS含量及凋亡的影響
　　FCM結果表明，與對照組相比，SW620細胞內的ROS含量及細胞凋亡率隨芹菜素濃度的升高而增加。芹菜素作用后，晚期凋亡和壞死的細胞均明顯多于對照組，且凋亡細胞數(shù)目隨芹菜素的濃度增高而增加，呈現(xiàn)濃度依賴性。Hoechst33258染色后可見，對照組細

11、胞核大，核內的熒光染色淺，且亮度均一，呈淡藍色。不同濃度的芹菜素處理后可見細胞出現(xiàn)凋亡，細胞數(shù)目隨芹菜素濃度增大而逐漸減少，出現(xiàn)細胞凋亡形態(tài)學改變，包括凋亡細胞核固縮，細胞核碎裂成塊狀、著色深而呈亮藍色，生成凋亡小體。
　　結論:
　　1.對SW620細胞增殖的抑制作用
　　芹菜素能抑制對人結腸癌細胞株SW620細胞的增殖具有抑制作用，且具有濃度和時間依賴性。芹菜素作用24、48、72hr檢測發(fā)現(xiàn)，隨著芹菜素濃度增加，

12、對細胞的抑制作用顯著增強，10μM的芹菜素作用48hr時，SW620細胞的增殖受到明顯抑制，表明10μM可能是芹菜素在體外發(fā)揮藥效的最低濃度。這有助于為芹菜素抗結腸癌的進一步研究及其臨床用藥提供藥效時間的依據(jù)。
　　2.對SW620細胞SGLT1通路及葡萄糖攝取的影響
　　葡萄糖轉運蛋白1(GLUT1)及鈉依賴性葡萄糖轉運載體(SGLT1)是目前已知體內分布最為廣泛的兩個葡萄糖轉運體，其主要參與葡萄糖跨膜轉運的正常生理過程，

13、腫瘤細胞攝取葡萄糖增加主要通過增加GLUT1及SGLT1的跨膜轉運，來實現(xiàn)自身對能量的高攝取。本實驗通過檢測SW620細胞葡萄糖消耗量，表明芹菜素作用后的SW620細胞葡萄糖消耗量均明顯減少，且隨著芹菜素濃度增加，其抑制SW620細胞攝取葡萄糖的作用越明顯，具有劑量依賴性。與此相應，芹菜素同時也下調SW620細胞的GLUT1及SGLT1蛋白表達水平，故我們推測，芹菜素對SW620細胞的葡萄糖攝取的影響，可能是與抑制細胞增殖，調節(jié)GLUT

14、1及SGLT1蛋白表達有關，這也可能是芹菜素抗腫瘤的作用機制之一。
　　.3對SW620細胞多胺含量的影響
　　多胺是一類廣泛分布于組織細胞內的天然小分子脂肪族物質，包括腐胺(putrescine，Put)、精脒(spermidine，Spd)和精胺(spermine，Spm)，其中以精胺的活性及作用最強。多胺對哺乳動物細胞的生長，增殖及分化起到了重要的調控作用，而腫瘤組織中多胺含量遠高于正常組織。本實驗通過檢測SW620細

15、胞內的多胺含量，芹菜素作用后的SW620細胞精胺及精脒減少，腐胺稍有增多，總多胺含量減少，表明其促進了多胺的代謝分解，且隨著芹菜素濃度增加，其促進SW620多胺代謝的作用越明顯，具有劑量依賴性。
　　4.對SW620細胞ODC/SSAT表達的影響
　　鳥氨酸脫羧酶(Ornithine decarboxylase，ODC)是多胺合成的限速酶，對多胺的胞內合成起到至關重要的調控作用，而精胺/精脒-N1-乙酰基轉移酶(spermi

16、dine/spermineN1-acetyltransferase，SSAT)為多胺分解代謝的限速酶。本實驗通過檢測SW620細胞內的ODC及SSAT的蛋白及mRNA的表達，表明芹菜素作用后的SW620細胞SSAT蛋白及mRNA表達上調，ODC與對照組并無明顯差異，這與多胺含量改變也表現(xiàn)一致。
　　5.對SW620細胞ROS含量及凋亡的影響
　　多胺代謝分解過程中會產生次生代謝產物ROS，ROS的胞內積聚會誘導細胞凋亡熒光染