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文檔簡(jiǎn)介
1、背景與目的:
原發(fā)性醛固酮增多癥(簡(jiǎn)稱原醛癥)是腎上腺皮質(zhì)病變引起醛固酮分泌增多,導(dǎo)致潴鈉排鉀、體液容量增加,從而抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)的一種疾病,主要表現(xiàn)為低腎素、高血壓伴(或不伴)低血鉀、堿中毒、夜尿增加。原醛癥患者多有中重度難以控制的高血壓,同時(shí)其心血管及代謝性并發(fā)癥較原發(fā)性高血壓具有更高的危險(xiǎn)性。Apelin是新近發(fā)現(xiàn)的一類小分子生物活性肽,是血管緊張素受體相關(guān)蛋白(angiotensin receptor-like
2、 protein J,APJ)的天然配體,其在體內(nèi)具有多種亞型,其中Apelin-13作為亞型之一,具有較強(qiáng)的生物活性。Apelin已被證明具有舒張血管降低血壓,增強(qiáng)心肌收縮力,調(diào)節(jié)體液穩(wěn)態(tài),調(diào)節(jié)胰島素分泌,促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移、血管形成等作用,從而使Apelin/APJ系統(tǒng)有望成為原醛癥合并心血管及代謝性并發(fā)癥的治療新靶點(diǎn)。本研究主要通過(guò)體外觀察Apelin-13逆轉(zhuǎn)醛固酮對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)細(xì)胞功能的損傷及其相關(guān)機(jī)制。
3、其中第一部分通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察Apelin-13逆轉(zhuǎn)醛固酮對(duì)HUVECs增殖及血管成形功能的影響,同時(shí)篩選出Apelin-13逆轉(zhuǎn)醛固酮對(duì)HUVECs細(xì)胞功能損傷時(shí)表達(dá)水平顯著變化的mRNA;第二部分觀察Apelin-13逆轉(zhuǎn)醛固酮促進(jìn)HUVECs衰老的作用并探討血管內(nèi)皮細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白在該逆轉(zhuǎn)過(guò)程中表達(dá)量的變化及其信號(hào)通路,從而為原醛癥并發(fā)癥的預(yù)防及治療提供新的思路。
方法:
第一部分:用含10%胎牛血清的1640培
4、養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,取第10~15代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。醛固酮作用HUVECs24小時(shí)后,加或不加Apelin-13繼續(xù)干預(yù)24小時(shí),用MTS試驗(yàn)檢測(cè)HUVECs的增殖、Matrigel基質(zhì)膠檢測(cè)HUVECs的血管形成狀況。通過(guò)文獻(xiàn)檢索,選取12種內(nèi)皮細(xì)胞血管成形功能相關(guān)mRNA(Angiopoietin-1,Angiopoietin-2,VEGFA,VEGFR-1,VEGFR-2,Tie-2,EGF, FGF-2,eNOS,H
5、O-1,HIF-1α,Sin-3),qRT-PCR法篩選Apelin-13逆轉(zhuǎn)醛固酮損傷作用時(shí)表達(dá)水平顯著變化的mRNA。同時(shí)利用APJ siRNA轉(zhuǎn)染HUVECs從而下調(diào)其細(xì)胞內(nèi)Apelin受體水平,采用MTS試驗(yàn),Matrigel基質(zhì)膠檢測(cè)HUVECs的增殖和血管成形能力。第二部分:體外培養(yǎng)HUVECs、藥物干預(yù)處理及APJ siRNA轉(zhuǎn)染HUVECs均同第一部分,采用β-半乳糖苷酶染色鑒定衰老細(xì)胞。進(jìn)一步采用Western-Blo
6、t檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞衰老功能相關(guān)的蛋白(Sirt-1,eNOS),觀察Apelin-13逆轉(zhuǎn)醛固酮誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞衰老時(shí)上述蛋白的表達(dá)水平。
結(jié)果:
第一部分:10nmol/L醛固酮干預(yù)后HUVECs的增殖、血管形成受到抑制,而醛固酮作用24小時(shí)后再加入1umol/l Apelin-13繼續(xù)干預(yù)24小時(shí)后,HUVECs的增殖、血管成形較醛固酮單獨(dú)作用組明顯改善。qRT-PCR法檢測(cè)顯示Apelin-13顯著逆轉(zhuǎn)了醛固酮
7、單獨(dú)作用時(shí)所引起的Ang-1,Ang-2,VEGFR-1、VEGFR-2及Tie-2表達(dá)水平降低的狀態(tài)。進(jìn)一步使用APJ siRNA下調(diào)Apelin受體的表達(dá)可消除Apelin-13逆轉(zhuǎn)醛固酮對(duì)HUVECs增殖和血管形成的抑制作用。
第二部分:同第一部分藥物干預(yù)后,Apelin-13逆轉(zhuǎn)了醛固酮誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞衰老功能。Western-Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),Apelin-13逆轉(zhuǎn)了醛固酮對(duì)HUVECs細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白Sirt
8、-1,eNOS的下調(diào)作用。
結(jié)論:
第一部分:醛固酮可抑制HUVECs增殖和血管形成能力,而Apelin-13可逆轉(zhuǎn)其對(duì)HUVECs增殖和血管成形功能的損傷作用。其中Ang-1、Ang-2、VEGFR-1、VEGFR-2、Tie-2在Apelin-13逆轉(zhuǎn)醛固酮增殖和血管成形功能損傷作用中表達(dá)水平升高,可能在介導(dǎo)Apelin-13逆轉(zhuǎn)醛固酮對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞血管形成損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
第二部分:醛固酮可促進(jìn)H
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