胃癌不同分化層級細(xì)胞的分離鑒定及在過繼免疫治療中的應(yīng)用.pdf

1、背景：
　　胃癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居惡性腫瘤第二位。常規(guī)治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是胃癌患者死亡的重要原因。因此如何遏制胃癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是目前研究的重點(diǎn)，而近年來腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSC)理論的提出為胃癌治療提供了新的思路。CSC理論認(rèn)為，只有一小部分腫瘤細(xì)胞具有自我更新和無限增殖能力，并由此產(chǎn)生大量相對成熟的常規(guī)腫瘤細(xì)胞(regular cancer cells，RCC)，這些處于腫瘤分化

2、層級頂點(diǎn)的細(xì)胞亞群是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。研究人員堅(jiān)信只有真正消滅CSC，才能根除腫瘤。但到目前為止，仍缺少合適的篩選CSC方法，這也極大的限制了人們對包括胃癌干細(xì)胞(gastric cancer stem cells，GCSC)在內(nèi)的CSC研究。
　　我們知道，正常祖細(xì)胞群仍具有一定程度的“干性”，同時(shí)也表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物。以此類推，腫瘤祖細(xì)胞（cancer progenitor cells，CPC）也極有可能具有這種特點(diǎn)。而

3、目前篩選CSC的辦法無法排除CPC的存在，因此也有研究用到了CSC/CPC來描述獲得的干性細(xì)胞群。然而CSC與CPC的生物學(xué)特性可能存在著較大差異，這種混雜的細(xì)胞群可能無法真實(shí)反映出這兩個(gè)細(xì)胞亞群的生物學(xué)特性。另一方面，CSC理論是建立在正常組織干細(xì)胞理論基礎(chǔ)上提出的，即腫瘤組織中應(yīng)該具有類似正常組織干細(xì)胞中由干細(xì)胞到祖細(xì)胞再到成熟細(xì)胞的漸進(jìn)分化過程。但是目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)僅是將腫瘤細(xì)胞群單純的分為CSC與非CSC，這不足以說明這種分化過程的

4、存在。由此可見，如果能找到合適的方法在腫瘤細(xì)胞群中分選出CSC、CPC及RCC，將對深入了解GCSC的生物學(xué)特性及完善CSC理論有著重要意義。
　　由于需要在腫瘤干性細(xì)胞群中篩選出干性程度高的CSC群與干性程度低的CPC群，因此只有選擇與細(xì)胞干性密切相關(guān)并可區(qū)分出強(qiáng)弱表達(dá)的標(biāo)記物才具有可行性。乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)具有這種特性，ALDH是細(xì)胞內(nèi)具有解毒作用的酶類，且在正常干細(xì)胞(ste

5、m cells，SC)的增殖、分化過程中發(fā)揮著重要作用。ALDH作為一種功能性的SC標(biāo)記物，具有在干細(xì)胞中高活性，成熟細(xì)胞中低活性或無活性的特點(diǎn)，其活性的高低可以反映出細(xì)胞的干性程度。而近年來，已有大量研究人員應(yīng)用ALDH活性檢測方式成功富集了CSC。雖然這些獲得的“CSC”仍存在著與CPC混雜的問題，但基于ALDH這種隨著細(xì)胞“干性”遞減而表達(dá)量逐步下降的特點(diǎn)或許可以成為篩選腫瘤細(xì)胞中不同分化層級細(xì)胞亞群的標(biāo)記物。
　　基于樹突

6、狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)的過繼免疫治療（adoptive cellularimmunotherapy，ACI）被認(rèn)為具有良好的應(yīng)用前景，以DC荷載抗原誘導(dǎo)成熟的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic t lymphocyte，CTL)更是具有高靶向性高殺傷性腫瘤細(xì)胞的優(yōu)勢。同時(shí)已有研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用過繼免疫治療靶向CSC會(huì)取得更好的療效。但是在GCSC及胃癌祖細(xì)胞（gastric cancer progenitor ce

7、lls，GCPC）方面的應(yīng)用未見報(bào)道。
　　目的：
　　1.利用ALDH活性評估方式分選胃癌細(xì)胞中不同分化層級亞群
　　2.探明胃癌細(xì)胞中不同分化層級亞群的生物學(xué)特性
　　3.明確靶向胃癌細(xì)胞中不同分化層級亞群的CTL抑瘤效果
　　方法：
　　1.流式細(xì)胞技術(shù)檢測胃癌細(xì)胞系MFC中ALDH活性強(qiáng)度:根據(jù)檢測結(jié)果，選取ALDH陽性細(xì)胞群中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的細(xì)胞亞群作為ALDHhigh群，選取ALDH陽性細(xì)胞

8、群中熒光強(qiáng)度最弱的細(xì)胞亞群作為ALDHlow群，選取ALDH陰性細(xì)胞群中的相對熒光強(qiáng)度最弱的細(xì)胞亞群作為ALDHneg群。
　　2.流式細(xì)胞技術(shù)檢測各亞群細(xì)胞CD44、CD133表達(dá)情況及細(xì)胞周期分析。
　　3.RT-PCR技術(shù)檢測各亞群細(xì)胞OCT-4、 SOX-2基因的表達(dá)情況。
　　4.體外成球?qū)嶒?yàn)評估各亞群細(xì)胞自我更新能力。
　　5.小鼠皮下致瘤實(shí)驗(yàn)探究各亞群細(xì)胞致瘤能力。
　　6.CCK8法檢測各亞

9、群細(xì)胞增殖及耐藥能力。
　　7.Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各亞群細(xì)胞侵襲能力。
　　8.平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測各亞群細(xì)胞克隆能力。
　　9.應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.ALDH活性表達(dá)與MFC細(xì)胞干性相關(guān)
　　(1) MFC中ALDH陽性細(xì)胞群比例占5％±0.91％，我們以ALDH陽性群中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的1％細(xì)胞亞群作為ALDHhigh亞群，ALDH陽性群中熒光強(qiáng)度最

10、弱的1％細(xì)胞亞群作為ALDHlow亞群，相對無ALDH活性的1％細(xì)胞群作為ALDHneg亞群。(2)三群細(xì)胞中，CD44比例均大于90％，不適合作為MFC的干性標(biāo)記物;而隨著ALDH活性的降低，CD133比例逐漸下降，分別為(44.07％±3.97％、34.33％±3.06％、1.60％±0.66％)，ALDHhigh及ALDHlow表達(dá)量明顯高于ALD Hneg(P＜0.01)，ALDHhigh比例雖高于ALDHlow，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

11、(P=0.09)。(3)干性基因OCT-4、SOX-2表達(dá)也呈現(xiàn)同樣的趨勢，其中OCT-4在ALDHhigh、ALDHlow及ALDHneg群相對表達(dá)量分別為(0.99±0.10;0.43±0.04;0.28±0.03，P＜0.05);SOX-2趨勢同OCT-4，表達(dá)量分別(1.00±0.08;0.63±0.05;0.14±0.03，P＜0.05)。(4) ALDHhigh及ALDHlow均可在無血清超低粘附條件下形成腫瘤球。相同時(shí)間內(nèi)

12、，ALDHhigh形成的腫瘤球體積明顯小于ALDHlow，而ALDHhigh球體內(nèi)ALDH陽性細(xì)胞比例明顯大于ALDHlow(70.1％±7.1％ VS30.5％±5.7％，P＜0.01);ALDHlow細(xì)胞亞群在5000/只致瘤條件下致瘤能力強(qiáng)于其他組，而在500/只致瘤條件下，ALDHhigh致瘤能力最強(qiáng)。
　　2.ALDH不同活性細(xì)胞亞群生物學(xué)特性不同
　　(1)ALDHlow細(xì)胞亞群體外增殖能力強(qiáng)于其他組，而ALDH

13、high亞群增殖能力最低;(2)S/G2/M期在ALDHhigh、ALDHlow及ALDHneg細(xì)胞亞群中比例分別為(40.6％±4.6％;91.1％±1.3％;60.5％±3.4％)組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);(3)隨著 ALDH活性下降，各細(xì)胞亞群耐藥能力逐步下降;(4)ALDHlow細(xì)胞亞群形成的克隆數(shù)量為(166.3±14.9)明顯多于其他組(P＜0.01)，而ALDHhigh細(xì)胞亞群克隆數(shù)量多于ALDHneg細(xì)胞亞群(

14、36.1±6.3;8.0±2.6，P＜0.05)。(5)ALDHhigh組侵襲能力明顯強(qiáng)于其他組(51.7±9.1，P＜0.05)，而ALDHlow組侵襲細(xì)胞數(shù)量與ALDHneg組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(9.7±3.5;11.7±3.6，P=0.895)。
　　3.CTL靶向ALDH各細(xì)胞亞群具有不同的抑瘤效果
　　CTL各治療組小鼠抑瘤率由高到底分別為CTL-ALDHow、CTL-ALDHhigh、CTL-ALDHneg(

15、88.2％±6.3％,68.7％±11.3％;43.2％±29.6％);CTL-ALDHhigh、CTL-ALDHlow、CTL-ALDHeg及PBS對照組外周血CD3+T細(xì)胞比例分別為(53.4％±2.7％;52.2％±3.8％;52.3％±6.1％;44.1％±3.2％)，各治療組比例均大于PBS對照組，但CTL-ALDHneg組與PBS組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.216)，各治療組之間無明顯差異。上述組序中外周血CD3+CD8+T

16、細(xì)胞比例均高于PBS對照組(24.4％±3.2％;26.3％±1.7％;21.9％±2.5％;11.5％±1.8％;P＜0.01)。組間無明顯差異。上述組序中脾臟血的CD3+T細(xì)胞比例分別為(20.3％±2.3％;19.06％±1.4％;19.4％±4.7％;10.2％±2.1％)，各治療組比例均大于PBS對照組(P＜0.05)，治療組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;上述組序中脾臟血的CD3+CD8+T細(xì)胞比例分別為(6.7％±2.0％;5.4％±0.

17、9％;5.8％±0.5％;1.8％±0.5％)，各治療組比例均明顯高于PBS對照組(P＜0.05)，各治療組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.胃癌干性細(xì)胞群中存在著生物學(xué)特性不同的CSC與CPC，ALDH活性分選可以作為區(qū)分CSC與CPC的方法;在干性群中排除CPC是以后提高CSC研究結(jié)果可靠度的有效方式。
　　2.CPC與CSC相比，雖然自我更新能力較低，但增殖能力更高，短時(shí)間內(nèi)的危害要高于CSC。
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