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文檔簡介
1、目的與背景: 肺癌是最常見的惡性腫瘤。目前,手術(shù)切除仍然是肺癌的主要治療手段。但是在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的肺癌患者中約80%在診斷時已屬晚期或有轉(zhuǎn)移,失去了手術(shù)治療的機會,放化療技術(shù)近年來雖有較大發(fā)展,但其治療中晚期肺癌患者仍有一定的局限性。而目前自體或臍血CIK細胞過繼免疫治療等生物療法在抗腫瘤方面的研究已經(jīng)取得了一定的進展。有文獻報道臍血CIK細胞在體外的擴增能力和殺傷活性兩個方面均優(yōu)于自體CIK細胞[1]。但是臍血CIK細胞輸入患者后
2、的療效還有待于進一步臨床試驗去檢驗。本研究擬通過分離誘導(dǎo)臍血單個核細胞產(chǎn)生CIK細胞后,將產(chǎn)生的臍血CIK細胞輸注入在本院收集的惡性腫瘤患者靜脈血進行生物治療,進行療效觀察。同時觀察經(jīng)過繼免疫治療后的腫瘤患者外周血的PBMC對瘤細胞(人紅白血病細胞株K562、人肝癌細胞株Hepa-CEA+及Hepa-CEA-) 的自然殺傷作用(或NK活性),以期為臍血CIK細胞過繼免疫治療惡性腫瘤患者的臨床療效研究提供一定依據(jù)。 方法:
3、 1.臍血CIK細胞的誘導(dǎo)制備:無菌條件下采集臍血后,用Ficoll-Hypaque淋巴分離液分離出臍血單個核細胞,在該單個核細胞濃度為3-5×10<'6>/ml的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中加入INF-γ至終濃度為1000U/ml。培養(yǎng)24h后,加入IL-1、IL-2、CD3MeAb等細胞因子,使其終濃度分別為100U/ml,1000U/ml,300U/ml。隔天半量換液,保持IL-2的終濃度為1000U/ml。培養(yǎng)7天后收集CI
4、K細胞,并進行臍血CIK細胞的計數(shù)、活度測定及其殺傷活性(或細胞毒活性)的測定。同時檢測鑒定誘導(dǎo)產(chǎn)生的臍血CIK細胞的免疫表型,并進行臍血CIK細胞的安全性檢測。 2.臍血CIK細胞過繼免疫治療中晚期肺癌病人:收集的臍血CIK細胞經(jīng)靜脈輸注入肺癌病人,每次輸注CIK細胞數(shù)為2~8×10<'8>,每天或隔天輸注一次,共輸注6~10次,總細胞數(shù)為2.5~6.2×10<'8>。分別于輸注CIK細胞最后一次當(dāng)天或第2天抽取4-5ml靜脈
5、血,以觀察CIK細胞療效。并于免疫治療前也分別常規(guī)采集靜脈血,分離出單個核細胞以進行免疫功能變化檢測。 3.流式細胞術(shù)(FMC)檢測經(jīng)過繼免疫治療的肺癌病人外周血中淋巴細胞計數(shù)的變化:無菌條件下采集經(jīng)臍血CIK細胞過繼免疫治療前后的肺癌病人外周血,用Ficoll淋巴液分離出病人外周血淋巴細胞,于流式細胞儀上進行檢測各種淋巴細胞的絕對計數(shù),以觀察治療前后淋巴細胞計數(shù)的變化情況。 4.MTT法檢測經(jīng)過繼免疫治療的肺癌病人外周
6、血PBMC對靶細胞 (K562、Hepa-CEA+及Hepa-CEA-細胞)的體外NK殺傷活性:于無菌條件下采集病人治療前后的外周血,用Ficoll淋巴液分離液分離出外周血單個核細胞PBMC,以此PBMC細胞為效應(yīng)細胞,以K562、Hepa-CEA+及Hepa-CEA-細胞為靶細胞,用MTT法檢測病人外周血PBMC對該靶細胞的NK殺傷活性。 結(jié)果: 1.臍血CIK細胞的制備:誘導(dǎo)的臍血CIK細胞具有CD3<'+>CD56
7、<'+>,且CD3<'+>與CD56<'+>均達90%以上,經(jīng)安全性檢測,臍血CIK細胞無細菌、無病毒及內(nèi)毒素污染,安全可靠。 2.臍血CIK細胞過繼免疫治療中晚期肺癌病人:臍血CIK細胞靜脈輸注肺癌病人后,病人主觀無不良反應(yīng),且病人免疫系統(tǒng)功能有所改善。 3.流式細胞術(shù)檢測經(jīng)過繼免疫治療的肺癌病人外周血中T淋巴細胞亞群計數(shù)的變化:經(jīng)臍血CIK細胞過繼免疫治療肺癌病人后,肺癌病人外周血T、Th、Ts淋巴細胞計數(shù)增加,且T
8、、Th淋巴細胞數(shù)增加幅度較大。但Th/Ts比值幾無變化。 4.流式細胞術(shù)檢測經(jīng)過繼免疫治療的肺癌病人外周血中B淋巴細胞及NK細胞計數(shù)的變化:過繼免疫治療后,肺癌病人外周血B淋巴細胞及NK細胞計數(shù)雖有增加,但不明顯。 5.MTT法檢測過繼免疫治療的肺癌病人外周血PBMC對K562的體外細胞毒活性:過繼免疫治療后,肺癌病人外周血PBMC對K562的體外NK殺傷活性雖然增加不顯著,但結(jié)合專業(yè)意義,其殺傷活性還是有所增加。
9、 6.MTT法檢測過繼免疫治療的肺癌病人外周血PBMC對Hepa-CEA+及Hepa-CEA-細胞的殺傷活性:在專業(yè)意義上,該病人外周血PBMC對Hepa-CEA+細胞的殺傷活性增加比對Hepa-CEA-細胞的殺傷活性增加的要多,盡管二者殺傷活性改變幅度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論: 1.制備的臍血CIK細胞安全、可靠,可用于本試驗中晚期肺癌患者的過繼免疫治療研究。 2.中晚期肺癌病人經(jīng)臍血CIK細胞過繼免疫治療后
10、,其免疫功能有不同程度的改善,T、B淋巴細胞及NK細胞均有不同程度的升高,其中以T及Th淋巴細胞升高較為普遍。 3.臍血CIK細胞對中晚期肺癌病人過繼免疫治療療效的主要免疫學(xué)指標(biāo)可能為T及Th淋巴細胞計數(shù)變化情況。 4.臍血CIK細胞作用于腫瘤細胞是以T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫為主,而T及Th淋巴細胞增殖可能是臍血CIK細胞抑制肺癌細胞生長的主要環(huán)節(jié)。 5.臍血CIK細胞過繼免疫治療肺癌患者后,其外周血的單個核細胞
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