臍血CIK細胞過繼免疫治療中晚期肺癌病人的臨床研究.pdf

1、目的與背景: 肺癌是最常見的惡性腫瘤。目前，手術(shù)切除仍然是肺癌的主要治療手段。但是在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的肺癌患者中約80％在診斷時已屬晚期或有轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)治療的機會，放化療技術(shù)近年來雖有較大發(fā)展，但其治療中晚期肺癌患者仍有一定的局限性。而目前自體或臍血CIK細胞過繼免疫治療等生物療法在抗腫瘤方面的研究已經(jīng)取得了一定的進展。有文獻報道臍血CIK細胞在體外的擴增能力和殺傷活性兩個方面均優(yōu)于自體CIK細胞[1]。但是臍血CIK細胞輸入患者后

2、的療效還有待于進一步臨床試驗去檢驗。本研究擬通過分離誘導(dǎo)臍血單個核細胞產(chǎn)生CIK細胞后，將產(chǎn)生的臍血CIK細胞輸注入在本院收集的惡性腫瘤患者靜脈血進行生物治療，進行療效觀察。同時觀察經(jīng)過繼免疫治療后的腫瘤患者外周血的PBMC對瘤細胞(人紅白血病細胞株K562、人肝癌細胞株Hepa-CEA+及Hepa-CEA-) 的自然殺傷作用(或NK活性)，以期為臍血CIK細胞過繼免疫治療惡性腫瘤患者的臨床療效研究提供一定依據(jù)。 方法:

3、 1．臍血CIK細胞的誘導(dǎo)制備：無菌條件下采集臍血后，用Ficoll-Hypaque淋巴分離液分離出臍血單個核細胞，在該單個核細胞濃度為3-5×10<'6>/ml的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中加入INF-γ至終濃度為1000U/ml。培養(yǎng)24h后，加入IL-1、IL-2、CD3MeAb等細胞因子，使其終濃度分別為100U/ml，1000U/ml，300U/ml。隔天半量換液，保持IL-2的終濃度為1000U/ml。培養(yǎng)7天后收集CI

4、K細胞，并進行臍血CIK細胞的計數(shù)、活度測定及其殺傷活性(或細胞毒活性)的測定。同時檢測鑒定誘導(dǎo)產(chǎn)生的臍血CIK細胞的免疫表型，并進行臍血CIK細胞的安全性檢測。 2．臍血CIK細胞過繼免疫治療中晚期肺癌病人：收集的臍血CIK細胞經(jīng)靜脈輸注入肺癌病人，每次輸注CIK細胞數(shù)為2～8×10<'8>，每天或隔天輸注一次，共輸注6～10次，總細胞數(shù)為2.5～6.2×10<'8>。分別于輸注CIK細胞最后一次當(dāng)天或第2天抽取4-5ml靜脈

5、血，以觀察CIK細胞療效。并于免疫治療前也分別常規(guī)采集靜脈血，分離出單個核細胞以進行免疫功能變化檢測。 3．流式細胞術(shù)(FMC)檢測經(jīng)過繼免疫治療的肺癌病人外周血中淋巴細胞計數(shù)的變化：無菌條件下采集經(jīng)臍血CIK細胞過繼免疫治療前后的肺癌病人外周血，用Ficoll淋巴液分離出病人外周血淋巴細胞，于流式細胞儀上進行檢測各種淋巴細胞的絕對計數(shù)，以觀察治療前后淋巴細胞計數(shù)的變化情況。 4．MTT法檢測經(jīng)過繼免疫治療的肺癌病人外周

6、血PBMC對靶細胞 (K562、Hepa-CEA+及Hepa-CEA-細胞)的體外NK殺傷活性：于無菌條件下采集病人治療前后的外周血，用Ficoll淋巴液分離液分離出外周血單個核細胞PBMC，以此PBMC細胞為效應(yīng)細胞，以K562、Hepa-CEA+及Hepa-CEA-細胞為靶細胞，用MTT法檢測病人外周血PBMC對該靶細胞的NK殺傷活性。 結(jié)果: 1．臍血CIK細胞的制備：誘導(dǎo)的臍血CIK細胞具有CD3<'+>CD56

7、<'+>，且CD3<'+>與CD56<'+>均達90％以上，經(jīng)安全性檢測，臍血CIK細胞無細菌、無病毒及內(nèi)毒素污染，安全可靠。 2．臍血CIK細胞過繼免疫治療中晚期肺癌病人：臍血CIK細胞靜脈輸注肺癌病人后，病人主觀無不良反應(yīng)，且病人免疫系統(tǒng)功能有所改善。 3．流式細胞術(shù)檢測經(jīng)過繼免疫治療的肺癌病人外周血中T淋巴細胞亞群計數(shù)的變化：經(jīng)臍血CIK細胞過繼免疫治療肺癌病人后，肺癌病人外周血T、Th、Ts淋巴細胞計數(shù)增加，且T

8、、Th淋巴細胞數(shù)增加幅度較大。但Th/Ts比值幾無變化。 4．流式細胞術(shù)檢測經(jīng)過繼免疫治療的肺癌病人外周血中B淋巴細胞及NK細胞計數(shù)的變化：過繼免疫治療后，肺癌病人外周血B淋巴細胞及NK細胞計數(shù)雖有增加，但不明顯。 5．MTT法檢測過繼免疫治療的肺癌病人外周血PBMC對K562的體外細胞毒活性：過繼免疫治療后，肺癌病人外周血PBMC對K562的體外NK殺傷活性雖然增加不顯著，但結(jié)合專業(yè)意義，其殺傷活性還是有所增加。

9、 6．MTT法檢測過繼免疫治療的肺癌病人外周血PBMC對Hepa-CEA+及Hepa-CEA-細胞的殺傷活性：在專業(yè)意義上，該病人外周血PBMC對Hepa-CEA+細胞的殺傷活性增加比對Hepa-CEA-細胞的殺傷活性增加的要多，盡管二者殺傷活性改變幅度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論: 1．制備的臍血CIK細胞安全、可靠，可用于本試驗中晚期肺癌患者的過繼免疫治療研究。 2．中晚期肺癌病人經(jīng)臍血CIK細胞過繼免疫治療后

10、，其免疫功能有不同程度的改善，T、B淋巴細胞及NK細胞均有不同程度的升高，其中以T及Th淋巴細胞升高較為普遍。 3．臍血CIK細胞對中晚期肺癌病人過繼免疫治療療效的主要免疫學(xué)指標(biāo)可能為T及Th淋巴細胞計數(shù)變化情況。 4．臍血CIK細胞作用于腫瘤細胞是以T淋巴細胞介導(dǎo)的細胞免疫為主，而T及Th淋巴細胞增殖可能是臍血CIK細胞抑制肺癌細胞生長的主要環(huán)節(jié)。 5．臍血CIK細胞過繼免疫治療肺癌患者后，其外周血的單個核細胞