內(nèi)皮祖細胞Notch4信號通路在川崎病模型冠脈損傷及修復(fù)中作用的研究.pdf

1、研究背景:
　　川崎病(Kawasaki disease)，是一種自限性全身血管炎性綜合征，為5歲以下嬰幼兒的急性發(fā)熱出疹性疾病，屬于自身免疫炎癥性疾病。由日本兒科醫(yī)師Tomisaku Kawasaki在1967年首先報道，開始以為是罕見疾病，但目前川崎病已取代風濕熱成為許多國家（亞裔國家多見）嬰幼兒和兒童獲得性心臟病的首要病因，也是我國常見的成人心血管疾病的病因之一。病程中內(nèi)皮細胞壞死、脫落可以導(dǎo)致血管內(nèi)膜受損、平滑肌層和膠原暴

2、露、血小板凝聚，上述病理過程進而加重了炎癥反應(yīng)，使血管壁結(jié)構(gòu)完整性被破壞，最終致冠脈狹窄或阻塞，甚至冠狀動脈瘤。
　　內(nèi)皮祖細胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，能夠在內(nèi)源性或（和）外源性刺激因素作用下促進內(nèi)皮修復(fù)和血管新生，能夠維持血管內(nèi)皮完整性，從而維持血流動力學(xué)的穩(wěn)定。組織缺血缺氧或內(nèi)皮損傷時，骨髓EPCs被動員至外周血，通過增殖、遷移、歸巢、分化整合至內(nèi)皮缺損部

3、位，參與血管損傷的修復(fù)以及微血管生成過程。促進EPCs的增殖、動員及分化，增加外周血循環(huán)EPCs的數(shù)量，將是冠狀動脈損傷治療的新方向。而目前關(guān)于內(nèi)皮祖細胞的定義，生物學(xué)特性，動員、遷移、歸巢及分化的具體過程及詳細機制都不甚清楚或者存在很大爭議。
　　Notch4信號介導(dǎo)的細胞間通訊在心血管發(fā)育及修復(fù)過程中有重要作用，Notch4信號通路是維持造血干細胞以及EPCs等細胞未分化狀態(tài)的關(guān)鍵。EPCs表面存在Notch4受體，與相應(yīng)配體

4、結(jié)合后能夠促進EPCs增殖、分化及動靜脈轉(zhuǎn)化等過程，在血管生成與修復(fù)中起重要調(diào)控作用，因此Notch4信號在EPCs生物活性調(diào)控和增殖、分化成熟中起到關(guān)鍵作用。
　　鑒于川崎病病因及發(fā)病機制仍不明確，而川崎病患兒EPCs狀態(tài)的臨床研究有限，且受到細胞間相互作用、藥物干預(yù)及倫理學(xué)等多方面問題的制約，我們無法深入研究EPCs的真實狀態(tài)。因此，本研究通過干酪乳桿菌細胞壁萃取物(LCWE)免疫刺激構(gòu)建小鼠川崎病冠狀動脈病變模型，檢測小鼠骨

5、髓EPCs含量及Notch4的表達，同時進行體外培養(yǎng)，研究川崎病冠狀動脈損傷時，EPCs的含量、Notch4的表達及EPCs功能的改變，以及在mRNA和蛋白水平上Notch4及其下游信號RBP-Jκ的表達變化。
　　目的:
　　通過LCWE誘導(dǎo)川崎病冠脈損傷的小鼠模型，在其不同病程階段探究骨髓EPCs含量、Notch4的表達和EPCs功能的改變及Notch4-RBP-Jκ信號通路在川崎病冠脈損傷及修復(fù)中的作用。
　　方

6、法:
　　第一部分:小鼠骨髓EPCs的培養(yǎng)及功能檢測與鑒定
　　1.用干酪乳桿菌制備干酪乳桿菌細胞壁萃取物（LCWE）。
　　2.BALB/C品系雄性小鼠，通過單次腹腔注射LCWE，建立小鼠川崎病冠狀動脈損傷模型。
　　3.用密度梯度離心法獲取小鼠骨髓單個核細胞，用EGM-2培養(yǎng)7天后進行相關(guān)檢測。
　　4.細胞增殖活力檢測:用CCK試劑盒檢測細胞增殖活力，用酶標儀測定在450nm處的吸光度，并計算其活力。

7、
　　5.細胞粘附能力檢測:用胰酶消化細胞，并重新接種于24孔板內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30min后，PBS沖洗后顯微鏡下計數(shù)貼壁細胞。
　　6.細胞遷移能力檢測:用插入式Transwell24孔板檢測細胞遷移能力，在顯微鏡下進行細胞計數(shù)。
　　7.體外血管形成能力:將EPCs接種于ECMatrix膠上，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，并于4、6、8、10、12h在顯微鏡下觀察?。ㄑ┕苌汕闆r。
　　8.免疫熒光
　　(1

8、)免疫雙熒光鑒定:用DiI-acLDL和FITC-UEA-I孵育細胞，用DAPI染核，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。
　　(2) RBP-Jκ和VEGFR-2免疫熒光檢測:分別用RBP-Jκ和VEGFR-2抗體孵育細胞，用DAPI染核，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。
　　第二部分:檢測川崎病不同病程階段小鼠骨髓EPCs含量和Notch4的表達
　　1.分別取LCWE腹腔注射后3d，7d，14d，28d的小鼠及對等時間的對照組小

9、鼠，分離出骨髓單個核細胞，用CD34-eFluro660，Notch4-PE，F(xiàn)lk-1-FITC，CD45-Percp-cy5.5標記細胞，用流式細胞術(shù)檢測EPCs和Notch4(+)EPC的含量。
　　2.體外培養(yǎng)小鼠骨髓EPCs7天后，用胰酶消化細胞，制備細胞懸液，同樣用流式細胞術(shù)檢測EPCs和Notch4(+)EPC的含量。
　　第三部分:熒光定量PCR檢測NOTCH4、RBP-Jκ信號通路、及內(nèi)皮相關(guān)因子P-Sel

10、ectin、VCAM-1的mRNA的表達
　　定量PCR檢測體外培養(yǎng)的小鼠骨髓EPCs的NOTCH4、RBP-Jκ、P-Selectin、VCAM-1在mRNA水平的表達。
　　第四部分:Western Blot檢測體外培養(yǎng)的小鼠骨髓EPCs的RBP-Jκ、VEGFR-2蛋白的表達
　　提取體外培養(yǎng)的小鼠骨髓EPCs的總蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗、二抗，加化學(xué)發(fā)光底物顯色，顯影等步驟，獲得蛋白

11、表達的影像，掃描并分析蛋白條帶灰度值。
　　結(jié)果:
　　第一部分:體外培養(yǎng)的小鼠骨髓EPCs的功能檢測與鑒定
　　1.體外培養(yǎng)的川崎病小鼠模型骨髓EPCs集落形成能力顯著降低。
　　2.體外培養(yǎng)的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的增殖活力明顯低于對照組。
　　3.體外培養(yǎng)的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的粘附能力明顯低于對照組。
　　4.體外培養(yǎng)的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的遷移能力明顯低于對照組。
　　

12、5.體外培養(yǎng)的川崎病小鼠模型骨髓EPCs的體外血管形成能力能力明顯低于對照組。
　　6.免疫熒光
　　(1)免疫雙熒光鑒定:各LCWE處理組雙陽性率明顯低于對照組。
　　(2) RBP-Jκ陽性表達率:LCWE處理組在3d組、7d組、14d組明顯低于對照組。
　　(3) VEGFR-2陽性表達率:LCWE處理組在3d組、7d組、14d組明顯低于對照組。
　　第二部分:小鼠骨髓EPCs的含量和Notch4的表

13、達
　　1.取骨髓單個核細胞直接流式檢測結(jié)果:各LCWE處理組的EPCs含量明顯低于對照組。而LCWE處理組在3d組、7d組、14組Notch4(+) EPCs含量卻明顯高于對照組，28d組Notch4(+) EPCs含量雖然也高于對照組，但差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.體外培養(yǎng)的川崎病小鼠模型骨髓EPCs含量明顯低于對照組。而Notch4(+)EPCs含量卻明顯高于對照組。
　　第三部分:體外培養(yǎng)的小鼠骨髓EPCs

14、的NOTCH4、RBP-Jκ、P-Selectin、VCAM-1的mRNA水平
　　1.NOTCH4 mRNA:3d組LCWE處理組的mRNA表達水平明顯低于對照組。
　　2.RBP-Jκ mRNA:3d、7d組LCWE處理組的mRNA表達水平明顯低于對照組。
　　3.P-Selectin mRNA:3d組LCWE處理組的mRNA表達水平明顯低于對照組。
　　4.VCAM-1 mRNA:各LCWE處理組與對照組差

15、異均無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。
　　第四部分:體外培養(yǎng)的小鼠骨髓EPCs的RBP-Jκ和VRGFR-2蛋白的表達
　　1.RBP-Jκ蛋白:3d組LCWE處理組RBP-Jκ蛋白表達明顯低于對照組。
　　2.VRGFR-2蛋白:各LCWE處理組與對照組差異均無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.川崎病小鼠模型的骨髓EPCs數(shù)量明顯減少。
　　2.川崎病小鼠模型的骨髓EPCs的各項功能和生物活性嚴重受損。