內皮祖細胞在高眼壓視神經損傷修復中作用的初步研究.pdf

1、一、急性原發(fā)性閉角型青光眼患者外周血內皮祖細胞數(shù)量變化
　　目的：觀察急性原發(fā)性閉角型青光眼(acute primary angle-closureglaucoma，APACG)患者外周血內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)數(shù)量的變化規(guī)律，探討EPCs在APACG患者眼壓升高導致視神經損傷中的作用。
　　方法：采用隊列研究設計，試驗為前瞻性研究。選取天津醫(yī)科大學總醫(yī)院眼科確診的AP

2、ACG患者30例為APACG組，健康體檢者20例為正常對照組。所有入選者取外周靜脈血2 ml，經反復離心過濾后，通過流式細胞儀鑒定EPCs，觀察APACG患者外周血EPCs數(shù)量的變化，并對其相關影響因素(視神經損害程度、經藥物治療后眼壓、空腹血糖、血脂、青光眼病程及有無心血管疾病)進行分析。
　　結果：兩組患者間性別、年齡、血管危險因素、血液生化指標的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，APACG組患者眼壓明顯高于正常對照組，差異

3、有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。外周血EPCs為CD34、CD133雙陽性反應，APACG組及正常對照組外周血EPCs數(shù)量分別為(48±22)個/ml和(65±20)個/ml，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.004)。1期與3期視神經損害者外周血EPCs數(shù)量分別為(60±19)個/ml和(34±7)個/ml，差異有統(tǒng)計學意義(Z=-3.015，P=0.002)。APACG組患者外周血EPCs數(shù)量與藥物治療后的平均眼壓在一定范圍內呈負相關

4、(r=-0.835，P<0.05)，與空腹血糖水平、血脂水平、青光眼病程間均無明顯相關性(r=0.343，P=0.227；r=-0.203，P=0.419；r=0.198，P=0.610)。APACG組有心血管疾病與無心血管疾病患者間外周血EPCs計數(shù)分別為(56±22)個/ml和(35±15)個/ml，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.005)。
　　結論：APACG患者外周血EPCs數(shù)量較正常人明顯減少，提示青光眼發(fā)生發(fā)展的病理因素對

5、外周血EPCs數(shù)量有一定影響。
　　二、大鼠高眼壓模型視網膜神經節(jié)細胞凋亡及外周血內皮祖細胞數(shù)量的變化
　　目的：觀察大鼠高眼壓模型外周血EPCs數(shù)量及視網膜神經節(jié)細胞(Retinalganglion cells，RGCs)凋亡的變化，探索EPCs在高眼壓視神經損傷修復中的作用。
　　方法：采用多波長激光532nm綠光光凝角鞏膜緣靜脈和上鞏膜靜脈的方法建立大鼠高眼壓模型，單眼造模。將100只大鼠隨機分為正常對照組20只

6、、激光對照組(眼壓正常)30只和高眼壓模型組50只。對正常對照組20只、激光對照組制備成功后3天、7天、3周時(每組10只大鼠)及高眼壓模型組大鼠在造模成功后3天、7天、3周、2月、3月時(每組10只大鼠)先行內眥靜脈取血1.5ml，采用流式細胞術測定外周血EPCs數(shù)量，再處死大鼠，取眼球行病理切片視網膜HE染色、末端脫氧核糖核酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL法)檢測RGCs凋亡以及免疫組織化學法檢測Bc1-2和Bax表

7、達。
　　結果：
　　(1)造模前測量全部大鼠的平均眼壓為9.9±1.2mmHg，多波長激光532nm綠光光凝大鼠角鞏膜緣靜脈和上鞏膜靜脈后眼壓馬上開始升高，造模后3天眼壓達到高峰，為37.4±1.5mmHg，而后逐漸緩慢下降，3月末仍高于正常8mmHg以上。造模成功率100％。
　　(2)正常對照組大鼠外周血EPCs數(shù)量平均為(62.1±13.1)個/ml，眼壓升高3天時外周血EPCs數(shù)量到達高峰，為(121.34±

8、22.4)個/ml，以后開始下降，7天時為(81.34±23.7)個/ml，至3周末達到最低，為(46.1±15.8)個/ml，而后緩慢升高，2月、3月時分別為(54.4±19.1)、(54.7±15.9)個/ml，有低于正常值的趨勢，經單因素方差分析有統(tǒng)計學差異(F=23.98，P<0.001)。
　　(3)大鼠高眼壓模型組視網膜HE染色和正常對照組相比，眼壓升高3天、7天、3周大鼠視網膜形態(tài)未見明顯差異；高眼壓2月時，視網膜各

9、層明顯變薄，以外核層最為顯著，神經節(jié)細胞數(shù)量顯著減少；高眼壓3月時可見視網膜變薄進一步加重，外核層更薄，神經節(jié)細胞數(shù)量更少，排列更加紊亂。
　　(4)大鼠高眼壓模型組Bax免疫組化陽性細胞比例和正常對照組相比，高眼壓3天、7天未見明顯差異，高眼壓3周、2月、3月陽性細胞比例明顯增高；Bc1-2免疫組化陽性細胞比例和正常對照組相比，高眼壓3天、7天、3周未見明顯差異，高眼壓2月、3月陽性細胞比例明顯增高；大鼠高眼壓模型組視網膜TUN

10、EL陽性細胞比例隨病程逐漸增高。
　　結論：成功制備出大鼠高眼壓模型；證實眼壓升高對外周血EPCs數(shù)量存在時間依賴性的影響；隨眼壓升高時間延長，視網膜病變逐漸加重，視網膜感光細胞數(shù)量逐漸減少；視網膜凋亡細胞逐漸增多，凋亡細胞分布于RCGs層、內叢狀層、內核層、外核層。提示EPCs在眼壓升高導致RGCs凋亡、視神經損傷的過程中可能發(fā)揮某種作用。
　　三、大鼠高眼壓模型視網膜HIF-1α、外周血VEGF-A、SDF-1、NO、E

11、T-1的變化及其與EPCs的關系
　　目的：觀察大鼠高眼壓模型視網膜缺氧誘導因子-1α(hypoxia-induciblefactor-1α，HIF-1α)的表達，外周血血管內皮生長因子-A(Vascular endothelialgrowth factor-A，VEGF-A)、基質細胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1α，SDF-1)、一氧化氮(Nitric oxide，NO)、內皮素-1(

12、Endothelin-1，ET-1)的變化及其與EPCs數(shù)量變化的關系，探討HIF-1α、VEGF-A、SDF-1對EPCs動員、招募的影響以及EPCs對血管內皮功能的影響。
　　方法：將190只大鼠隨機分為正常對照組20只、激光對照組(眼壓正常)20只和高眼壓模型組150只。正常對照組10只、激光對照組10只及高眼壓模型組在造模成功后3天、7天、3周、2月、3月時(每個時間點20只大鼠)，行股動脈放血10ml，離心后取血清，EL

13、ISA技術檢測外周血VEGF-A、SDF-1、NO及ET-1水平。正常對照組10只、激光對照組10只及高眼壓模型組在造模成功后3天、7天、3周、2月、3月時(每個時間點10只大鼠)，脫頸處死大鼠，摘除眼球取視網膜組織，Western blot技術檢測視網膜HIF-1α的蛋白水平。
　　結果：
　　(1)HIF-1α蛋白在正常視網膜中呈低濃度表達，眼壓升高3天表達明顯上升，7天時達到高峰，隨后有所下降，但仍高于正常對照組。

14、r>　　(2)正常對照組、大鼠高眼壓模型3天、7天、3周、2月、3月組外周血VEGF-A為84.89±4.89ng/L，59.24±6.37ng/L，58.36±5.68ng/L，54.98±5.91ng/L，59.99±5.12ng/L，64.78±5.94ng/L。與正常對照組相比，眼壓升高外周血VEGF-A均明顯降低(P<0.001)。
　　(3)正常對照組、大鼠高眼壓模型3天、7天、3周、2月、3月組外周血SDF-1為22

15、9.43±11.61pg/ml，218.34±11.33pg/ml，298.51±32.02pg/ml，294.16±11.90 pg/ml，301.10±14.61pg/ml，307.49±20.46pg/ml。與正常對照組及眼壓升高3天相比，眼壓升高7天、3周、2月、3月外周血SDF-1均明顯升高(P<0.001)。
　　(4)正常對照組、大鼠高眼壓模型3天、7天、3周、2月、3月組外周血NO為36.74±5.19μmol/L

16、，32.87±4.30μmol/L，45.67±4.48μmol/L，41.29±5.00μmol/L，41.04±5.15μmol/L，41.45±4.82μmol/L。與正常對照組相比，眼壓升高3天外周血NO顯著降低(P=0.038)，眼壓升高7天、3周、2月、3月外周血NO明顯升高(P<0.05)。
　　(5)正常對照組、大鼠高眼壓模型3天、7天、3周、2月、3月組外周血ET-1為72.73±6.41ng/L，57.96±4

17、.42ng/L，70.86±12.14ng/L，77.37±9.95ng/L，76.57±5.85ng/L，77.41±7.43ng/L。與正常對照組相比，眼壓升高3天外周血ET-1顯著降低(P<0.001)。
　　結論：眼壓升高使視網膜組織缺血、缺氧，HIF-1α表達升高，促進骨髓EPCs的動員，外周血VEGF-A水平降低，SDF-1水平升高，進而促進EPCs向缺血、缺氧的視網膜組織轉移，外周血EPCs、NO及ET-1呈時間依賴

18、性變化。提示HIF-1α、VEGF-A、SDF-1可能通過參與EPCs的動員和遷移，在高眼壓視神經損傷修復過程中發(fā)揮作用，并對血管內皮功能產生影響。
　　四、辛伐他汀對大鼠高眼壓模型RGCs凋亡、外周血EPCs數(shù)量及視網膜HIF-1α、外周血及視網膜VEGF-A、SDF-1、NO、ET-1的影響
　　目的：觀察辛伐他汀對大鼠高眼壓模型眼壓、RGCs凋亡、外周血EPCs數(shù)量及視網膜HIF-1α、外周血及視網膜VEGF-A、SD

19、F-1、NO、ET-1的影響，探索辛伐他汀促進EPCs的動員在青光眼視神經損傷修復過程中的作用。
　　方法：將100只大鼠隨機分為正常對照組(CON，10只)、高眼壓模型組(OH，30只)、高眼壓辛伐他汀干預組(SV，30只)和高眼壓生理鹽水組(NS，30只)。高眼壓辛伐他汀干預組為高眼壓造模成功后，隨機選取大鼠30只，以20mg/kg辛伐他汀溶于1ml生理鹽水進行灌胃。高眼壓生理鹽水組為高眼壓造模成功后，隨機選取大30只，以1m

20、l/只/天進行灌胃。SV組于開始藥物干預后3天、7天、3周檢測眼壓1次，行內眥靜脈取血1.5ml采用流式細胞儀測定外周血EPCs數(shù)量，3周時脫頸處死后取右眼(6眼)進行視網膜HE染色、凋亡細胞檢測以及免疫組織化學法Ba1-2、Bax檢測。NS組于3天、7天、3周檢測眼壓1次，行內眥靜脈取血1.5ml測定外周血EPCs數(shù)量。
　　將160只大鼠隨機分為正常對照組(CON，30只)、高眼壓模型組(OH，50只)、高眼壓辛伐他汀干預組(

21、SV，50只)和高眼壓生理鹽水組(NS，30只)。CON組10只、OH組20只、SV組20只和NS組10只(共60只)于開始藥物干預后3周行股動脈放血10ml，離心后取血清，采用ELISA技術檢測外周血VEGF-A、SDF-1、NO及ET-1的水平。CON組10只、OH組10只、SV組10只和NS組10只(共40只)于開始藥物干預后3周脫頸處死動物，摘除眼球，采用western blot技術檢測視網膜HIF-1α蛋白水平。CON組10只

22、、OH組20只、SV組20只和NS組10只(共60只)于開始藥物干預后3周脫頸處死動物，摘除眼球，采用ELISA技術檢測視網膜VEGF-A、SDF-1、NO及ET-1的水平。
　　結果：
　　(1)高眼壓模型組于眼壓升高3天、7天、3周的平均眼壓分別為37.44±1.5mmHg，31.84±4.1mmHg，25.94±2.2mmHg；高眼壓辛伐他汀干預組3天、7天、3周的平均眼壓分別為38.0±3.7 mmHg，33.9±2

23、.9 mmHg，24.9±3.2mmHg。辛伐他汀對大鼠眼壓未表現(xiàn)出顯著影響(P>0.05)。
　　(2)高眼壓模型組于眼壓升高后3天、7天、3周外周血EPCs數(shù)量分別為(121.3±22.4)、(81.3±23.7)、(46.1±15.8)個/ml；高眼壓辛伐他汀干預組3天、7天、3周外周血EPCs數(shù)量分別為(138.5±41.4)、(77.9±22.0)、(65.0±13.6)個/ml。服用辛伐他汀3天和3周外周血EPCs均較

24、高眼壓模型組顯著升高(P<0.05)。
　　(3)辛伐他汀干預組大鼠與高眼壓模型組相比，HE染色視網膜各層形態(tài)稍整齊；Bc1-2陽性細胞數(shù)未見明顯差異，Bax陽性細胞比例降低，TUNEL陽性細胞比例明顯降低。
　　(4)正常對照組、大鼠高眼壓模型組、高眼壓辛伐他汀干預組、高眼壓生理鹽水組外周血VEGF-A分別為83.75±4.76ng/L、53.47±5.36ng/L、80.35±8.62ng/L、54.29±5.28ng/

25、L。與高眼壓模型組相比，辛伐他汀干預組外周血VEGF-A明顯升高(P<0.001)。
　　正常對照組、大鼠高眼壓模型組、高眼壓辛伐他汀干預組、高眼壓生理鹽水組視網膜VEGF-A分別為43.43±5.33ng/L、23.54±5.38ng/L、32.83±5.64ng/L、22.60±5.98ng/L。與高眼壓模型組相比，辛伐他汀干預組視網膜VEGF-A明顯升高(P<0.001)。
　　(5)正常對照組、大鼠高眼壓模型組、高眼

26、壓辛伐他汀干預組、高眼壓生理鹽水組外周血SDF-1分別為230.62±11.27pg/ml、296.28±12.14pg/ml、265.74±39.71pg/ml、291.72±12.21pg/ml。與高眼壓模型組相比，辛伐他汀干預組外周血SDF-1明顯降低(P=0.001)。
　　正常對照組、大鼠高眼壓模型組、高眼壓辛伐他汀干預組、高眼壓生理鹽水組 SDF-1分別為227.41±18.38pg/ml、187.72±19.19pg

27、/ml、212.14±23.71pg/ml、185.63±19.26pg/ml。與高眼壓模型組相比，辛伐他汀干預組視網膜SDF-1明顯升高(P<0.001)。
　　(6)正常對照組、大鼠高眼壓模型組、高眼壓辛伐他汀干預組、高眼壓生理鹽水組外周血NO分別為36.26±4.95μmol/L、41.16±4.97μmol/L、44.31±4.14μmol/L、40.94±4.31μmol/L。與高眼壓模型組相比，辛伐他汀干預組外周血NO

28、明顯升高(P=0.044)。
　　正常對照組、大鼠高眼壓模型組、高眼壓辛伐他汀干預組、高眼壓生理鹽水組視網膜NO分別為38.54±3.53μmol/L、32.20±3.74μmol/L、30.52±3.94μmol/L、31.16±3.36μmol/L。與高眼壓模型組相比，辛伐他汀干預組視網膜NO無顯著變化(P=0.159)。
　　(7)正常對照組、大鼠高眼壓模型組、高眼壓辛伐他汀干預組、高眼壓生理鹽水組外周血ET-1分別為

29、72.68±6.35ng/L、77.84±7.98ng/L、87.62±5.49ng/L、78.13±7.66ng/L。與高眼壓模型組相比，辛伐他汀干預組外周血ET-1明顯升高(P<0.001)。
　　正常對照組、大鼠高眼壓模型組、高眼壓辛伐他汀干預組、高眼壓生理鹽水組視網膜ET-1分別為53.13±2.07ng/L、28.39±3.33ng/L、39.09±4.81ng/L、28.20±2.65ng/L。與高眼壓模型組相比，辛伐