內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及IL-17A對(duì)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響及機(jī)制.pdf

1、研究目的
　　動(dòng)脈粥樣硬化引發(fā)的急性冠脈綜合征(acutecoronarysyndromes，ACS)，即不穩(wěn)定性心絞痛(unstableangina)和急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction，AMI)一直是發(fā)達(dá)國家以及某些發(fā)展中國家的首要致死和致殘疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全球有超過1900萬人罹患突然的冠狀動(dòng)脈疾病（ACS或者猝死），而大部分人事先并無缺血性心臟病等征兆。在我國，隨著人民生活水平提高和飲食習(xí)慣

2、的改變，動(dòng)脈粥樣硬化及其相關(guān)疾病的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)，成為主要的死亡原因。臨床研究表明引起ACS的主要原因是冠狀動(dòng)脈晚期粥樣硬化斑塊的突然破裂以及由此引發(fā)的血栓形成，而動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定是導(dǎo)致斑塊破裂的重要原因。因此，研究影響斑塊易損性的因素和機(jī)制，探索相應(yīng)的干預(yù)方法，對(duì)ACS的防治具有重要的價(jià)值。
　　動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生時(shí)血管壁局部的有害刺激，諸如氧化應(yīng)激、毒性脂質(zhì)等，可以擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，引起內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、

3、巨噬細(xì)胞等動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERstress)。當(dāng)ERstress發(fā)生時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的未折疊蛋白反應(yīng)(unfoldedproteinresponse，UPR)將作為一種補(bǔ)償機(jī)制發(fā)揮作用。然而，過度的ERstress會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，是引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊并促進(jìn)易損斑塊形成的一個(gè)重要病因。因此，阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能改善斑塊的易損性。四苯基丁酸（4-Phenylbutyricacid，PBA）作為一種化學(xué)伴侶，可以有效地緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

4、應(yīng)激與UPR的過度活化。用于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的干預(yù)措施是一種嶄新的嘗試。
　　IL-17A作為一種促炎性細(xì)胞因子，是新的T細(xì)胞亞群Th17的主要效應(yīng)分子，參與多種炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展，我們和其他學(xué)者的研究都顯示，IL-17A可以促進(jìn)小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成，但在斑塊不穩(wěn)定性中的作用尚不清楚。臨床資料數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)ACS病人外周血IL-17A的水平較穩(wěn)定性心絞痛和正常人明顯升高，提示IL-17A具有促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定性的作用，但在已有的動(dòng)物

5、模型研究中更加關(guān)注IL-17A對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊生成的影響，而且相關(guān)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果尚存在沖突。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)IL-17A可誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，在小鼠斑塊破裂模型中，IL-17A的水平也有所升高，這提示與斑塊發(fā)生相比，IL-17A對(duì)于晚期斑塊穩(wěn)定性的影響可能更大。但I(xiàn)L-17A與斑塊易損性之間的具體因果關(guān)系并不清楚，針對(duì)IL-17進(jìn)行抗體干預(yù)治療的效果也不明確。
　　本論文中，我們選取ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠斑

6、塊模型，研究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及IL-17A對(duì)斑塊易損性的影響以及相關(guān)機(jī)制，并分別采用四苯基丁酸(PBA)和IL-17中和性抗體(IL-17mAb)作為干預(yù)措施，觀察它們?cè)黾影邏K穩(wěn)定性的效果和意義。為更好地理解易損斑塊的形成機(jī)制打下基礎(chǔ)，也為臨床預(yù)防和救治急性冠脈綜合征等急性心血管事件提供新的思路。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　一、小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型
　　根據(jù)研究的側(cè)重點(diǎn)不同，我們分別采用ApoE-/-小鼠早期斑塊模型和晚期斑塊

7、模型。
　?。ㄒ唬〢poE-/-小鼠早期斑塊模型:8周齡雄性ApoE-/-小鼠高脂喂養(yǎng)2周，隨機(jī)分為兩組:①PBA治療組，每三天一次腹腔注射PBA，100mg/kg，共注射5周，至總周齡16周;②對(duì)照組給以同等劑量PBS腹腔注射。
　?。ǘ〢poE-/-小鼠晚期斑塊模型:8周齡雄性ApoE-/-小鼠高脂飲食喂養(yǎng)8周，確認(rèn)斑塊形成后，隨機(jī)分組分別進(jìn)行IL-17A與IL-17中和性抗體(IL-17mAb)干預(yù)實(shí)驗(yàn)。
　　

8、IL-17A干預(yù)實(shí)驗(yàn)包括:①IL-17A干預(yù)組:腹腔注射重組IL-17A，2μg/只，一周一次，注射4周;②對(duì)照組:以同等劑量的PBS替代IL-17A。
　　IL-17mAb干預(yù)實(shí)驗(yàn)包括:①IL-17mAb組:腹腔注射IL-17單克隆抗體（IL-17mAb），50μg/只，一周一次，注射4周;②同型對(duì)照組:以大鼠IgG2A作為IL-17mAb同型對(duì)照。
　　二、小鼠體重及血脂水平的檢測
　　為了檢測干預(yù)措施對(duì)于小鼠一般

9、健康狀況的影響以及對(duì)脂肪代謝的影響。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)終止前稱量每只小鼠的體重。并采集外周血，用全自動(dòng)生化分析儀檢測總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的水平。
　　三、免疫組化以及其他組織染色法
　　為了檢測各種干預(yù)措施對(duì)粥樣斑塊生成及易損性的影響，我們?nèi)⌒∈笾鲃?dòng)脈根部進(jìn)行連續(xù)組織切片，進(jìn)行如下的項(xiàng)目檢測:①H&E染色檢測斑塊大小、面積;②油紅0檢測斑塊脂質(zhì)含量;③免疫組化染色檢測斑塊局部平滑肌細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、p

10、-PERK、FOXP3等;④天狼星紅染色、Masson三色染色檢測膠原蛋白含量;⑤彈性纖維染色檢測彈性纖維含量;⑥原位明膠酶譜法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)活性;⑦TUNEL染色檢測斑塊凋亡情況;⑧免疫熒光染色檢測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)轉(zhuǎn)錄因子FOXP3。
　　組織染色后拍照，用Image-ProPlus軟件測量斑塊面積及陽性著色區(qū)域面積，并計(jì)算陽性區(qū)域占斑塊總面積的比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　四、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)

11、
　　為了說明各種干預(yù)措施對(duì)體內(nèi)炎癥情況的影響，我們?nèi)⌒∈笸庵苎?，離心獲得血清，用ELISA的方法檢測IL-23、IL-10、TGF-β、IL-35等動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)細(xì)胞因子水平。
　　五、實(shí)時(shí)定量PCR
　　為了更進(jìn)一步檢測斑塊局部的炎癥情況，我們?nèi)?shí)驗(yàn)動(dòng)物的胸腹主動(dòng)脈，組織研磨破碎后抽提RNA，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測各實(shí)驗(yàn)組炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ、IL-17、IL-23、IL-6以及抑炎因子I

12、L-10、TGF-β、IL-35相關(guān)亞單位和趨化因子MCP-1、CXCL-10和CX3CL-1的mRNA水平。
　　六、Westernblot
　　為了檢測PBA體內(nèi)抑制斑塊局部內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的效果，我們?nèi)⌒∈笮馗怪鲃?dòng)脈，組織破碎提取蛋白，用Westernblot的方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子p-eIF2α、eIF2α、sXBP-1的水平。
　　七、流式細(xì)胞術(shù)
　?。ㄒ唬┱{(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的檢測
　　為了檢測PBA

13、干預(yù)后對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)水平的影響，我們?nèi)⌒∈笃⑴K研磨成單細(xì)胞懸液，用PE-Cy5-CD4抗體和PE-Foxp3抗體共染。流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+Foxp3+雙陽性細(xì)胞占比，即為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群比例。
　?。ǘ┚奘杉?xì)胞凋亡清除能力的檢測
　　為了檢測IL-17A對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡清除能力的影響，我們?cè)隗w外做了巨噬細(xì)胞凋亡清除實(shí)驗(yàn)。具體方法是以地塞米松腹腔注射誘導(dǎo)的小鼠凋亡胸腺細(xì)胞為靶細(xì)胞，CFSE染色后加入到小鼠腹腔巨噬

14、細(xì)胞中共同培養(yǎng)。用FITC標(biāo)記的F4/80抗體標(biāo)染巨噬細(xì)胞，流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡檢測巨噬細(xì)胞中吞噬凋亡細(xì)胞的比例。
　?。ㄈ┘?xì)胞因子微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量技術(shù)(CBA)
　　為了節(jié)省血清標(biāo)本、提高檢測效率，我們采用流式微量檢測技術(shù)(CBA)檢測更多的細(xì)胞因子指標(biāo)。包括:IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-10等。
　　八、統(tǒng)計(jì)分析
　　用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以

15、均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式表示。非配對(duì)的t檢驗(yàn)法用于分析干預(yù)組與非干預(yù)組的差別，以p＜0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　一、PBA緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)小鼠斑塊易損性的影響
　　1、PBA體內(nèi)應(yīng)用對(duì)血管局部內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平的影響
　　對(duì)于小鼠胸腹主動(dòng)脈蛋白樣本的分析顯示，PBA體內(nèi)應(yīng)用后ERstress相關(guān)蛋白sXBP-1、p-eIF2a明顯減少。斑塊局部免疫組化的結(jié)果也顯示磷酸化PERK(p-PERK)的水平明

16、顯下降。說明PBA體內(nèi)應(yīng)用可以有效地緩解血管局部內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。
　　2、PBA干預(yù)對(duì)斑塊生成和斑塊穩(wěn)定性的影響
　　與對(duì)照組相比，PBA干預(yù)組胸腹主動(dòng)脈斑塊數(shù)量減少，主動(dòng)脈根部斑塊的面積也明顯下降。而且PBA干預(yù)組斑塊內(nèi)的平滑肌含量升高、CD3+T細(xì)胞浸潤減少、凋亡水平明顯減少。這些指標(biāo)提升斑塊穩(wěn)定性明顯增加。表明PBA治療可以有效地減少斑塊生成、增加斑塊的穩(wěn)定性。
　　3、PBA干預(yù)對(duì)小鼠脂質(zhì)代謝的影響
　

17、　PBA干預(yù)組與非干預(yù)組的體重及血脂水平均無明顯差異，說明PBA體內(nèi)干預(yù)不影響小鼠一般健康狀況，也不影響脂肪代謝。排除了血脂改變對(duì)于斑塊產(chǎn)生影響的可能。
　　4、PBA治療對(duì)于細(xì)胞因子的影響
　　外周血ELISA和CBA檢測發(fā)現(xiàn)PBA干預(yù)組促炎性細(xì)胞因子如IL-2、IL-4、TNF-α、IL-17、IFN-γ、IL-23等均沒有顯著變化。抑炎性的細(xì)胞因子IL-35的水平有明顯的上升，IL-10有升高的趨勢(shì)。對(duì)于血管局部的檢測

18、也顯示同樣的結(jié)果，即促炎性細(xì)胞因子的mRNA水平?jīng)]有顯著變化，而抑炎性的IL-10以及IL-35相關(guān)亞單位EBi3、IL-12α的mRNA水平有明顯升高。這些結(jié)果均提示在PBA緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后可以促進(jìn)抑炎因子的升高。
　　5、PBA治療對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響
　　調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是抑炎性細(xì)胞因子IL-10、IL-35的主要來源，因此我們檢測了PBA干預(yù)對(duì)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的影響。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)PBA治療組調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的占比

19、明顯升高。斑塊局部的FOXP3染色也發(fā)現(xiàn)PBA組FOXP3陽性數(shù)量明顯升高。這些結(jié)果證實(shí)PBA治療可以導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群的改變，從而引起抑炎因子的升高。
　　6、新的抑炎細(xì)胞因子IL-35與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系
　　在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)在PBA治療組新的抑炎因子IL-35的水平改變最為明顯。為了進(jìn)一步研究IL-35與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系，我們檢測了動(dòng)物模型中IL-35的水平。我們發(fā)現(xiàn)隨著斑塊的形成，IL-35的水平下降明顯。這提示

20、IL-35可能抑制動(dòng)脈粥樣硬化的生成，增加斑塊的穩(wěn)定性。
　　二、IL-17A對(duì)小鼠斑塊易損性的影響及機(jī)制
　　1、IL-17A對(duì)晚期斑塊大小和易損性的影響
　　盡管H&E染色發(fā)現(xiàn)IL-17A干預(yù)組斑塊的絕對(duì)面積和斑塊占血管橫截面面積的比例較對(duì)照組均沒有明顯的改變，這說明IL-17A不影響晚期斑塊的大小。但外源性IL-17A的干預(yù)導(dǎo)致斑塊脂質(zhì)含量增加、壞死核心占斑塊面積的比例增加、斑塊內(nèi)凋亡數(shù)量增加、CD3+T細(xì)胞含量

21、增加，而且平滑肌的含量降低。這些都說明IL-17A導(dǎo)致斑塊的穩(wěn)定性下降。
　　2、IL-17A對(duì)小鼠體重與脂質(zhì)代謝的影響
　　與對(duì)照組比較，IL-17A干預(yù)組的體重?zé)o明顯改變。外周血中TCH、TG、LDL、HDL等指標(biāo)均無變化。這說明IL-17A體內(nèi)應(yīng)用不影響小鼠一般狀況與脂質(zhì)代謝，其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響并非通過影響脂質(zhì)代謝而產(chǎn)生。
　　3、IL-17A對(duì)趨化因子的影響
　　為了研究IL-17A增加斑塊

22、CD3+T細(xì)胞含量的機(jī)制，我們用定量PCR的方法檢測了胸腹主動(dòng)脈局部趨化因子MCP-1、CXCL-10和CX3CL-1的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)IL-17A處理組MCP-1、CXCL-10的水平明顯升高。提示IL-17A可以上調(diào)趨化因子的水平，從而增加T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向斑塊局部的浸潤。
　　4、IL-17A對(duì)巨噬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凋亡清除能力的影響
　　為了研究導(dǎo)致斑塊局部凋亡增多的原因，我們?cè)隗w外檢測了oxLDL存在的情況下IL-1

23、7A對(duì)于巨噬細(xì)胞存活力的影響，以及IL-17A對(duì)于巨噬細(xì)胞凋亡清除能力的影響。在oxLDL存在的情況下加入IL-17A刺激48小時(shí)可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞死亡增加。對(duì)于凋亡清除能力的研究發(fā)現(xiàn)IL-17A可以下降巨噬細(xì)胞60分鐘時(shí)的凋亡清除能力，但對(duì)更長時(shí)間（90分鐘以后）的凋亡清除能力沒有影響。由此可見，在斑塊局部IL-17A可能降低巨噬細(xì)胞凋亡清除能力。更重要的是IL-17A與毒性脂質(zhì)(oxLDL)的共同作用可以導(dǎo)致巨噬細(xì)胞死亡，從而減少巨噬

24、細(xì)胞的含量，影響凋亡細(xì)胞的及時(shí)清除，導(dǎo)致斑塊局部凋亡數(shù)量增加。
　　5、IL-17抗體(IL-17mAb)對(duì)晚期斑塊易損性的影響
　　為了反向驗(yàn)證IL-17A對(duì)于斑塊穩(wěn)定性的影響，也為了觀察IL-17抗體干預(yù)治療的效果，我們?cè)O(shè)計(jì)了IL-17阻斷性抗體治療及其同型對(duì)照的實(shí)驗(yàn)組。與預(yù)期結(jié)果相符，IL-17mAb沒有改變晚期斑塊的大小但導(dǎo)致斑塊內(nèi)平滑肌的含量上升和CD3+T細(xì)胞水平下降。這些指標(biāo)均表明應(yīng)用抗體治療后可以有效地增加斑

25、塊穩(wěn)定性。具有積極的治療意義。
　　結(jié)論
　　一、PBA干預(yù)可以有效地緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的生成并促進(jìn)斑塊的穩(wěn)定。這一作用可能通過增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞含量，上調(diào)免疫負(fù)調(diào)控因子(IL-10、IL-35)的方式實(shí)現(xiàn)。
　　二、IL-17A不影響晚期斑塊的大小，但降低斑塊的穩(wěn)定性。IL-17A誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞死亡和巨噬細(xì)胞凋亡清除能力的降低可能是重要的機(jī)制。
　　三、IL-17中和性抗體治療可增加斑塊穩(wěn)定性。

26、
　　創(chuàng)新性與意義
　　1、發(fā)現(xiàn)PBA不僅能夠緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而且可以上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和抑制性細(xì)胞因子水平，減少動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的生成和斑塊易損性。并在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)IL-35與動(dòng)脈粥樣硬化疾病的關(guān)系。這些發(fā)現(xiàn)將有助于更好地理解此類疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為以PBA等類似藥物用于臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　2、發(fā)現(xiàn)IL-17A對(duì)于晚期斑塊易損性的影響以及阻斷IL-17的積極作用。發(fā)現(xiàn)與斑塊形成相比，IL-17A對(duì)于斑塊易