小劑量衣霉素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響及機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著人們生活方式的改變,特別是高脂高糖飲食,冠心病的發(fā)病率急劇上升,急性冠狀動(dòng)脈綜合征(Acute coronary syndrome,ACS)作為冠心病的一種急危重癥,嚴(yán)重危害了人類的健康。大量文獻(xiàn)報(bào)道,冠狀動(dòng)脈內(nèi)斑塊的形成及其穩(wěn)定性是決定ACS是否發(fā)生的重要因素,因此,ACS發(fā)生形成的重要基礎(chǔ)是不穩(wěn)定斑塊(unstable plaque,UP),并且UP的破裂及血栓形成是ACS最終引起惡性心血管事件發(fā)生的主要原

2、因。所以,為了臨床防治 ACS,提高患者生存質(zhì)量;改善疾病預(yù)后,降低其死亡率,對(duì)不穩(wěn)定斑塊的形成以及破裂的研究至關(guān)重要。然而,目前斑塊“不穩(wěn)定性”的具體機(jī)制仍不明確。
　　眾多研究顯示,巨噬細(xì)胞凋亡是造成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的重要因素,在晚期動(dòng)脈粥樣硬化中,巨噬細(xì)胞凋亡與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的發(fā)生密切相關(guān)。ERS是指某些原因引起的細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡、生理功能紊亂的過程。

3、傳統(tǒng)觀點(diǎn)及本課題組前期的研究均表明持久或和較為嚴(yán)重的ERS會(huì)誘導(dǎo)凋亡瀑布反應(yīng),促進(jìn)CHOP、JNK等分子表達(dá)和活化,最終引起細(xì)胞凋亡;然而適度的ERS可促進(jìn)錯(cuò)誤折疊和未折疊蛋白質(zhì)降解等方式使應(yīng)激得到緩解。最新研究報(bào)道發(fā)現(xiàn),適度的ERS可通過激活自噬,減少心肌組織的缺血再灌注損傷。那么適度ERS對(duì)AS有何影響目前尚不清楚。
　　自噬(Autophagy)是由溶酶體系統(tǒng)降解長(zhǎng)半衰期蛋白和細(xì)胞器的代謝途徑,可被饑餓、細(xì)胞分化和正常的生長(zhǎng)

4、調(diào)節(jié)激活,主要為了保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和存活。以往研究表明,激活巨噬細(xì)胞自噬顯著增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性,然而,在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展過程中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的關(guān)系以及最終對(duì)斑塊穩(wěn)定性的影響尚不清楚。衣霉素是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一種明確的激活劑,因此,我們以ApoE基因敲除(ApoE-/-)動(dòng)脈粥樣硬化小鼠為研究對(duì)象,建立不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型,觀察不同劑量衣霉素引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響,且觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的狀態(tài)。

5、體外應(yīng)用不同劑量衣霉素對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),檢測(cè)不同程度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響以及自噬在其中可能起到的作用。
　　研究目的：
　　1.體外構(gòu)建ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊模型,觀察不同劑量衣霉素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響,且觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和自噬的狀態(tài);
　　2.離體構(gòu)建泡沫細(xì)胞模型,模擬動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過程,觀察不同劑量衣霉素對(duì)泡沫細(xì)胞形成的影響;
　　3.探討不同劑量衣霉素影響泡沫細(xì)胞

6、形成的機(jī)制,尤其是自噬在其中可能起到的作用
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.取6-8周的ApoE-/-小鼠40只,給予高脂喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)將小鼠分為:對(duì)照組和手術(shù)組。手術(shù)組小鼠行右側(cè)頸總動(dòng)脈套管術(shù)（Perivascular carotid collar placement,PCCP),術(shù)后繼續(xù)高脂喂養(yǎng)9周。9周末取對(duì)照組和手術(shù)組小鼠頸動(dòng)脈,H&E染色觀察小鼠頸動(dòng)脈斑塊形成情況。
　　2.為了觀察不同劑量衣霉素對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊

7、穩(wěn)定性的影響,將小鼠分為四組:正常對(duì)照組、單純PCCP組、小劑量衣霉素組和大劑量衣霉素組。正常對(duì)照組和單純PCCP組給予生理鹽水腹腔注射,小劑量衣霉素組和大劑量衣霉素組分別給予小劑量衣霉素、大劑量衣霉素腹腔注射。2周后,處死小鼠,通過H&E染色觀察頸動(dòng)脈斑塊形態(tài),油紅O染色觀察斑塊內(nèi)脂質(zhì)聚集,抗巨噬細(xì)胞免疫組化染色觀察斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞聚集,Western-blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78和自噬標(biāo)志蛋白Atg7、p62的表達(dá)水平。<

8、br>　　3.體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW264.7,建立巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞模型。為了觀察不同劑量衣霉素對(duì)巨噬細(xì)胞的影響,將細(xì)胞隨機(jī)分為4組:(1)正常對(duì)照組,(2)ox-LDL組,(3)ox-LDL+0.1TM組,(4)ox-LDL+1.0TM組;進(jìn)而深入研究小劑量衣霉素影響泡沫細(xì)胞形成的具體機(jī)制及其與自噬的關(guān)系,將細(xì)胞隨機(jī)分為5組:(1)正常對(duì)照組,(2)ox-LDL組,(3)ox-LDL+0.1TM組,(4)ox-LDL+0.1TM+3-

9、MA組,(5)ox-LDL+Rapa組;分別通過油紅O染色檢測(cè)泡沫細(xì)胞含量,TUNEL檢測(cè)巨噬細(xì)胞凋亡以及 Western-blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白 GRP78和自噬標(biāo)志蛋白Atg7、p62的表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.行PCCP手術(shù)的ApoE-/-小鼠通過高脂喂養(yǎng)9周后,H&E染色結(jié)果顯示:手術(shù)組小鼠頸動(dòng)脈內(nèi)發(fā)現(xiàn)內(nèi)部脂質(zhì)池較大的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊,而對(duì)照組小鼠無斑塊形成,其頸動(dòng)脈管壁光滑。以上表明建模成功。

10、r>　　2.H&E染色結(jié)果顯示:與單純 PCCP組和大劑量衣霉素組相比,小劑量衣霉素組頸動(dòng)脈腔內(nèi)的斑塊脂質(zhì)池減少,斑塊結(jié)構(gòu)較為完整且相對(duì)穩(wěn)定;油紅O染色結(jié)果顯示:小劑量衣霉素組斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量顯著降低(P<0.05 vs單純PCCP組和大劑量衣霉素組);巨噬細(xì)胞免疫組化染色顯示:與單純PCCP組和大劑量衣霉素組相比,小劑量衣霉素組斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的含量顯著降低（P<0.05),Western-blot結(jié)果顯示:小劑量衣霉素干預(yù)誘導(dǎo)的一定程度

11、的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以適度上調(diào)自噬(P<0.05 vs單純PCCP組和大劑量衣霉素組)。
　　3.油紅O染色與TUNEL結(jié)果顯示:50 mg/L的ox-LDL可以成功模擬巨噬細(xì)胞泡沫化,發(fā)現(xiàn)大量富含紅色脂滴顆粒的巨噬細(xì)胞,并且誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞凋亡(P<0.01 vs正常對(duì)照組),而小劑量衣霉素干預(yù)后,巨噬細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴顆粒顯著減少且巨噬細(xì)胞凋亡減少(P<0.01 vs ox-LDL),而小劑量衣霉素的作用被自噬抑制劑3-MA抑制自噬后顯著

12、減弱(P<0.01 vs0.1TM+ox-LDL),但自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素又可模擬小劑量衣霉素的保護(hù)作用。
　　4.ox-LDL干預(yù)細(xì)胞后,GRP78和p62蛋白表達(dá)水平上調(diào),Atg7蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05 vs正常對(duì)照組)。小劑量衣霉素干預(yù)后,GRP78和p62蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào),Atg7蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05 vs ox-LDL and1.0TM+ox-LDL)。小劑量衣霉素的作用由于自噬抑制劑3-MA的加

13、入,被顯著減弱,Atg7蛋白表達(dá)水平下調(diào),p62蛋白表達(dá)水平相應(yīng)上調(diào)（P<0.05 vs0.1TM+ox-LDL),而GRP78的蛋白表達(dá)水平變化不明顯;自噬誘導(dǎo)劑Rapa干預(yù)后p62蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)、Atg7蛋白表達(dá)水平上調(diào),GRP78蛋白表達(dá)無顯著差異。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了不穩(wěn)定性較高的ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型;
　　2.小劑量衣霉素預(yù)處理ApoE-/-小鼠可以減小頸動(dòng)脈腔內(nèi)的斑塊脂質(zhì)