P364L突變對UGT1A1酶催化非結(jié)合膽紅素葡糖醛酸化的影響.pdf

1、以非結(jié)合膽紅素升高為主的先天性高膽紅素血癥在臨床中并不罕見，其中最常見的為1901年Gilbert和Lereboullet發(fā)現(xiàn)的Gilbert綜合癥，其次為Arias在1962年發(fā)現(xiàn)的Crigler-Najjar綜合癥Ⅱ型(CNS-Ⅱ)，最少見也最為致命的是1952年被Crigler和Najjar報道的Crigler-Najjar綜合癥Ⅰ型(CNS-Ⅰ)。GS、CNS-Ⅰ和CNS-Ⅱ發(fā)病機制相同，均為編碼尿苷二磷酸葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1

2、(UDP-glucuronosyltransferase1A1，UGT1A1)的基因發(fā)生突變，使突變的UGT1A1酶催化非結(jié)合膽紅素的活性下降。
　　目前已發(fā)現(xiàn)了130個UGT1A1基因上的突變位點，這些突變點大多位于外顯子1、2、5上，而外顯子3、4上的突變相對較少[1]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)了1例CNS-Ⅱ患者攜帶有外顯子上的純合突變c.1091C＞T。該突變點位于UGT1A1基因外顯子4上，使UGT1A1酶的第364個氨基酸由

3、脯氨酸突變?yōu)榱涟彼?P364L)。
　　以往的研究中關(guān)于P364L突變的報道較少，在非亞洲人群中至今還沒有該突變位點的報道，而課題組發(fā)現(xiàn)的CNS-Ⅱ患者攜帶P364L純合突變，是目前為止報道的第1例。為明確P364L突變酶對非結(jié)合膽紅素催化能力的影響我們構(gòu)建變異體進行實驗。
　　目的:UGT1A1基因外顯子4上的突變c.1091C＞T，導(dǎo)致UGT1A1酶的第364個氨基酸由脯氨酸突變?yōu)榱涟彼?，本實驗旨在驗證P364L突變酶催

4、化非結(jié)合膽紅素葡糖醛酸化能力的下降。
　　方法:以攜帶正常UGT1A1基因的野生型質(zhì)粒為模板，用核苷酸引物介導(dǎo)的定點突變法構(gòu)建攜帶c.1091C＞T基因的突變型質(zhì)粒。突變型質(zhì)粒測序并將測序結(jié)果與野生型質(zhì)粒比對，驗證突變型質(zhì)粒是否構(gòu)建準確。用突變型質(zhì)粒和野生型質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞，表達P364L突變酶和UGT1A1野生酶。提取用野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞后表達的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實時熒光定量方

5、法分別檢測野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒表達的差異。超聲破碎儀裂解HEK293細胞，低溫高速離心后留取上清。Western blot驗證UGT1A1野生酶及P364L突變酶的表達。繪制非結(jié)合膽紅素標準曲線，用UGT1A1野生酶和P364L突變酶分別催化非結(jié)合膽紅素與尿苷二磷酸葡糖醛酸(Uridine diphosphate glucuronic acid,UDPGA)的結(jié)合反應(yīng)，高效液相色譜儀（High performance liquid c

6、hromatograph，HPLC）定量分析非結(jié)合膽紅素濃度的變化，比較UGT1A1野生酶和P364L突變酶對非結(jié)合膽紅素葡糖醛酸化的催化活性。
　　結(jié)果:1.測序結(jié)果顯示野生型質(zhì)粒UGT1A1基因的第4個外顯子上的第1091個堿基由鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A)，對應(yīng)到互補鏈為胞嘧啶(C)突變?yōu)樾叵汆奏?T)，突變質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　2.Western blot檢測HEK293細胞轉(zhuǎn)染UGT1A1野生型和P364L突變型質(zhì)

7、粒后的蛋白表達，PVDF膜掃描顯示55KD左右處可見UGT1A1蛋白表達。
　　3.提取野生型、突變型質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細胞后表達的總RNA，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒表達無差異。
　　4.繪制非結(jié)合膽紅素標準曲線，得到方程式:y=0.0571x+0.1011，R2=0.9946（其中X為非結(jié)合膽紅素峰面積，Y為非結(jié)合膽紅素濃度μg/mL），非結(jié)合膽紅素濃度在0.31255μg/mL～5μg/mL

8、時與非結(jié)合膽紅素峰面積有良好的線性關(guān)系。
　　5.用分別轉(zhuǎn)染P364L突變質(zhì)粒和UGT1A1野生質(zhì)粒后的HEK293細胞均漿催化非結(jié)合膽紅素與UDPGA的酯化反應(yīng)，UGT1A1野生酶和P364L突變酶反應(yīng)組在15min內(nèi)非結(jié)合膽紅素濃度下降幅度最大，總體來講P364L突變酶催化組非結(jié)合膽紅素的濃度下降低于UGT1A1野生酶催化組。
　　結(jié)論:UGT1A1基因外顯子4上的突變c.1091C＞T使其翻譯合成的P364L突變酶催化