腐生葡萄球菌M36耐有機(jī)溶劑脂肪酶基因的克隆與表達(dá).pdf

1、生物柴油是生物質(zhì)能的一種形式，具有綠色、可再生、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，能夠緩解石油即將枯竭和環(huán)境污染對(duì)人類造成的危機(jī)，成為國(guó)內(nèi)外重點(diǎn)研究開發(fā)的熱點(diǎn)。與傳統(tǒng)的化學(xué)催化法相比，脂肪酶法合成生物柴油條件溫和、工序簡(jiǎn)單、能耗低、綠色環(huán)保。但是由于脂肪酶成本高，有機(jī)溶劑對(duì)脂肪酶有毒性，脂肪酶具有催化特異性等因素的影響，使酶法生產(chǎn)生物柴油難以有較大的突破和產(chǎn)業(yè)化。本研究主要對(duì)耐有機(jī)溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌腐生葡萄球菌M36脂肪酶基因lip3進(jìn)行克隆，并在大腸桿菌和

2、枯草芽孢桿菌中表達(dá)：還對(duì)lip5基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，以獲得耐有機(jī)溶劑的重組脂肪酶。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.腐生葡萄球菌M36脂肪酶基因的克隆。以腐生葡萄球菌M36為出發(fā)菌株。提取總DNA，采用PCR和Sitefinding-PCR的方法分別擴(kuò)增出741 bp和804 bp的成熟肽基因片段，lip3和lip5，GenBank登錄號(hào)分別為：FJ979867和FJ979868。
　　 2.Lip3基因在大腸桿菌中的表達(dá)及重

3、組酶性質(zhì)研究。將ltp3基因與大腸桿菌胞內(nèi)表達(dá)載體pET-DsbA連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-DsbA-lip3，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)過SDS-PAGE電泳、活性染色以及瓊脂顯色平板的檢測(cè)證明了lip3的正確表達(dá)。優(yōu)化誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，結(jié)果表明：在pH8的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為1.0時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h，重組酶活力最高達(dá)到25.8 U/mL。重組酶BL21/pE

4、T-DsbA-lip3通過Ni柱去除融合蛋白配體得到電泳純的腐生葡萄球菌，lip3脂肪酶蛋白，并研究重組酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明：重組酶BL21/pET-lip3最適反應(yīng)pH為8.0，最適反應(yīng)溫度為25℃：對(duì)甲醇、正己烷和正庚烷等有機(jī)溶劑有較好的耐性：Mg2+和β-巰基乙醇對(duì)重組酶有一定的激活作用。
　　 3.Lip3基因在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)及重組酶性質(zhì)研究。將lip3基因與枯草芽孢桿菌載體pHT43連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHT43

5、-lip3，電擊轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌DB104內(nèi)，實(shí)現(xiàn)了分泌型高效表達(dá)。對(duì)重組脂肪酶pHT43-lip3酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明：重組酶的最適反應(yīng)pH為8.0，最適反應(yīng)溫度為50℃：在乙醇、異丙醇、丙酮中保存1小時(shí)，酶活能保留50％以上，而異戊醇對(duì)脂肪酶的活力有提升作用：金屬離子和表面活性劑中，Na+、K+和β-巰基乙醇對(duì)重組酶有一定的激活作用。
　　 4.Lip35基因的定點(diǎn)突變及在枯草芽孢桿菌中的表達(dá)。應(yīng)用重疊延伸PCR的方

6、法構(gòu)建脂肪酶基因lip35的突變體lip35D93S，并連接枯草芽孢桿菌載體pHT43，在草芽孢桿菌DB104中進(jìn)行分泌型表達(dá)。結(jié)果表明：lip35原始基因一級(jí)結(jié)構(gòu)上保守的motifGly-His-Asp-Met-Gly（91～95位），活性中心的Ser變成了Asp，確實(shí)是導(dǎo)致其表達(dá)沒有活性的原因。對(duì)重組酶pHT43-lip5D93S的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，結(jié)果表明：最適反應(yīng)溫度為40℃，最適反應(yīng)pH為8.0，在異丙醇、正己烷、正庚烷、丙酮