來(lái)源于宏基因組耐有機(jī)溶劑新酯酶的克隆及酶學(xué)性質(zhì)表征.pdf

1、近年來(lái)，隨著宏基因組技術(shù)的出現(xiàn)和廣泛使用，顯著拓展了人們對(duì)環(huán)境微生物多樣性的認(rèn)識(shí)。宏基因組技術(shù)是指不經(jīng)過(guò)微生物培養(yǎng)，直接提取環(huán)境微生物的總基因組的技術(shù)。使用該技術(shù)，對(duì)原本在環(huán)境中超過(guò)99％的不可培養(yǎng)微生物基因的操作和研究成為了現(xiàn)實(shí)，這促使人們發(fā)現(xiàn)了大量具有價(jià)值的新的蛋白和活性小分子物質(zhì)。
　　 本課題研究采用宏基因組技術(shù)，針對(duì)來(lái)源于貴州銅仁梵凈山的土壤微生物樣本，構(gòu)建了一個(gè)庫(kù)容克隆數(shù)量達(dá)到5×104的宏基因組文庫(kù)?；谌∷岣视?/p>

2、酯水解生成透明圈的功能篩選方法，從文庫(kù)中分離出新酯酶全長(zhǎng)基因1條(命名為EstC23)。進(jìn)化關(guān)系分析表明，該酶隸屬于脂肪酶第Ⅳ家族(Hormone-sensitivelipase family，HSL)。對(duì)該基因的異源過(guò)表達(dá)研究表明，該基因在T7強(qiáng)啟動(dòng)子作用下，產(chǎn)生的可溶性蛋白占細(xì)胞總蛋白量的30％左右。純酶蛋白的酶學(xué)性質(zhì)表征顯示，EstC23在25℃pH8.0條件下，對(duì)pNP-butyrat的酶活達(dá)254 U mg-1，該酶的最適反應(yīng)

3、溫度為40℃，特別是在5-10℃低溫下仍能維持最大活性的50％。EstC23在濃度達(dá)50％(V/V)的非極性有機(jī)溶劑（高logP）中顯現(xiàn)出極強(qiáng)的穩(wěn)定性，尤其在50％(V/V)的苯類(lèi)和烷烴類(lèi)有機(jī)溶劑中，其活力能提升至92％至274％之間，孵育一周后酶活性不會(huì)降低。同時(shí)，酯酶EstC23能水解叔醇酯底物，這是通常的酯酶或脂肪酶不具備的底物活性。這些結(jié)果表明，EstC23在酯合成、手性化合物的拆分、不穩(wěn)定中間體化合物合成、肽合成等方面具有潛在

4、應(yīng)用價(jià)值。
　　 后續(xù)我們以EstC23核酸序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)特異性引物，基于宏基因組特異性PCR技術(shù)(Metageno mic Gene Specific PCR，MGS-PCR)和截?cái)嗪昊蚪M特異性PCR技術(shù)(Truncated Metagenomic Gene Specific PCR，TMGS-PCR)，對(duì)來(lái)自全國(guó)不同地域環(huán)境的65組宏基因組DNA進(jìn)行序列篩選，分別獲得了同源家族全長(zhǎng)功能基因7條和核心片段15條，序列分析比對(duì)