葡萄內(nèi)生菌中耐有機(jī)溶劑脂肪酶菌株的篩選及酶學(xué)特性研究.pdf

1、脂肪酶(Lipase, EC3.1.1.3)是分解三脂酰甘油的水解酶類(lèi),它不僅能將底物三脂酰甘油水解為丙三醇和脂肪酸,還能催化水解反應(yīng)的逆反應(yīng)。近年來(lái),隨著非水相酶學(xué)的不斷深入,脂肪酶的應(yīng)用已超出了油-水界面上進(jìn)行水解反應(yīng)的范圍,被廣泛應(yīng)用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中間體的選擇性保護(hù)、高聚物的合成、肽合成等方面,在醫(yī)藥、生物化工、食品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。微生物脂肪酶具有比動(dòng)植物脂肪酶更寬的反應(yīng)pH、適宜溫度范圍和很好的的

2、底物專(zhuān)一性,便于從工業(yè)生產(chǎn)中獲取高純度制劑,是當(dāng)前工業(yè)用脂肪酶的主要來(lái)源,而不同菌種來(lái)源的脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)和作用機(jī)理不同,同時(shí)不同菌種所需的營(yíng)養(yǎng)與培養(yǎng)條件也不同,探討菌種對(duì)不同溶劑的敏感性可為研究在有機(jī)溶劑中的催化反應(yīng)奠定基礎(chǔ)。
　　本文針對(duì)新疆釀酒葡萄內(nèi)生菌,從中篩選能夠產(chǎn)耐有機(jī)溶劑脂肪酶的菌株,確定其分類(lèi)學(xué)地位;優(yōu)化目標(biāo)菌產(chǎn)耐有機(jī)溶劑脂肪酶的發(fā)酵條件,提高菌株產(chǎn)酶能力,并對(duì)其粗酶液的酶學(xué)特性進(jìn)行研究。主要結(jié)果如下:
　　

3、1.耐有機(jī)溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選與鑒定:從已分離出的73株葡萄內(nèi)生菌中,采用羅丹明B平板法初篩得到8株產(chǎn)脂肪酶的內(nèi)生菌,再以1％正庚烷、1%甲苯為篩選壓力,經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)和遺傳穩(wěn)定性研究,確定產(chǎn)耐有機(jī)溶劑脂肪酶酶活力最高的1株內(nèi)生菌CJ。通過(guò)形態(tài)及26SrDNA-ITS分子生物學(xué)技術(shù)鑒定,確定該菌株為黑曲霉(Aspergillus niger),構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。
　　2.CJ產(chǎn)耐有機(jī)溶劑脂肪酶發(fā)酵條件的優(yōu)化:對(duì)影響目標(biāo)菌株產(chǎn)耐有

4、機(jī)溶劑脂肪酶的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了研究,得到最佳的發(fā)酵條件為:乳糖4g、蛋白胨6g、谷物調(diào)和油5ml、MnCl20.1g、pH7、裝液量25%、接種量3%、溫度30℃、轉(zhuǎn)速150r/min培養(yǎng)72h,此時(shí)耐有機(jī)溶劑脂肪酶產(chǎn)量可達(dá)8.75U/mL。
　　3.CJ產(chǎn)耐有機(jī)溶劑脂肪酶的粗酶學(xué)特性研究:CJ所產(chǎn)脂肪酶粗酶液的最適反應(yīng)溫度為40℃,最適反應(yīng)pH值為7.0;在50℃保溫1h酶活力保留54.55%,具有良好的熱穩(wěn)定性;在pH值

5、3.0~7.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定,有一定的耐酸性。金屬離子Mn2+對(duì)酶活力有促進(jìn)作用,Zn2+、Fe2+、Cu2+對(duì)酶活力有抑制作用,K+、Ca2+、Na+、Mg2+對(duì)酶活力影響不大。該酶在以葵花油和谷物調(diào)和油為底物時(shí),酶活分別為228%和180%,明顯高于橄欖油和油煙機(jī)廢油。在有機(jī)溶劑中,該粗酶液的酶活隨著有機(jī)溶劑濃度的增加而降低,在10%甲苯和丙酮中的半衰期較長(zhǎng),分別達(dá)62.4h和60.8h;在30%、50%的二甲苯中的半衰期都較長(zhǎng);有機(jī)