不同種類干細(xì)胞靜脈輸注對(duì)2型糖尿病大鼠治療效果的比較及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　2型糖尿病(T2DM)是一種慢性炎性疾病，其發(fā)病機(jī)制核心為胰島素抵抗和漸進(jìn)性胰島β細(xì)胞功能衰退，同時(shí)還涉及免疫失衡和胰島α細(xì)胞功能亢進(jìn)等其他病理生理過程。而干細(xì)胞因其可分泌多種生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)因子并具有多向分化潛能的特性，促使多項(xiàng)臨床及基礎(chǔ)研究在干細(xì)胞輸注治療糖尿病領(lǐng)域進(jìn)行了有益的探索。
　　選取何種干細(xì)胞、以達(dá)到最優(yōu)的治療效果，一直是研究者們最為關(guān)注的問題。骨髓造血干細(xì)胞或骨髓單核細(xì)胞輸注已被多項(xiàng)研究證實(shí)對(duì)T1DM

2、和T2DM療效確切，可降低血糖并改善胰島功能;但雖然其效果明顯，也具有不可避免的缺點(diǎn):骨髓干細(xì)胞的獲取為有創(chuàng)性操作，且患者自體骨髓造血干細(xì)胞的增殖、分泌能力會(huì)因長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境而受損;但若采用異體骨髓干細(xì)胞輸注，則又面臨著免疫抑制劑的使用及藥物副作用等問題。因此，越來越多的研究者們也將目光投向除骨髓造血干細(xì)胞外的其他種類干細(xì)胞，如免疫原性更低的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、來源更廣的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及無創(chuàng)性獲得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及臍血單個(gè)核細(xì)胞等。

3、現(xiàn)有的臨床研究顯示，以上幾種干細(xì)胞均可起到一定的平穩(wěn)血糖的作用，但在改善胰島功能方面不同研究之間尚存在一定的不一致性，尤其在改善胰島功能方面。目前為止尚未有研究在同一試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)下比較不同干細(xì)胞對(duì)血糖控制及胰島功能的改善作用?？紤]到既往單一干細(xì)胞輸注的臨床研究結(jié)果的不一致性，為了達(dá)到為不同患者制定符合其病情的精準(zhǔn)治療方案、篩選最優(yōu)的干細(xì)胞種類，因此在同一研究標(biāo)準(zhǔn)下比較不同干細(xì)胞輸注的有效性及各自療效側(cè)重就有很大臨床意義。
　　胰島是一

4、種高度血管化的組織，其體積占胰腺總體積的1-2％，但血流量卻占胰腺總血流的10-20％。鑒于此結(jié)構(gòu)的特殊性，胰島可迅速感知血糖及激素變化，但也使其極易遭受氧化應(yīng)激等有害刺激的損傷。一旦胰島微循環(huán)內(nèi)皮的完整性及功能受損，將導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的粘附、浸潤(rùn)增加，從而加劇胰島的破壞:因此，保護(hù)胰島微循環(huán)與保護(hù)胰島β細(xì)胞功能一樣重要。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)已在多項(xiàng)臨床研究及動(dòng)物試驗(yàn)中被證實(shí)能夠改善糖耐量和胰島功能，但其具體是通過分泌何種因子、激活哪條通

5、路達(dá)到的以上療效，仍少有研究報(bào)道。
　　Wnt蛋白是一類與生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖遷移與干細(xì)胞干性維持及分化調(diào)節(jié)有關(guān)的重要因子，一般由干細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等分化程度較低的細(xì)胞分泌，正常狀態(tài)下的成熟細(xì)胞僅表達(dá)少量的Wnt蛋白，但在組織損傷修復(fù)的過程中可一定程度上調(diào)。以細(xì)胞種類不同及作用濃度不同，Wnt蛋白可激活不同的下游通路，即的β-catenin依賴性的經(jīng)典Wnt通路，和β-catenin非依賴性的非經(jīng)典Wnt通路。既往的研究已證實(shí)Wnt通

6、路的激活可促進(jìn)病理/生理性的血管增生，并且在胰島β細(xì)胞中敲除β-catenin或其下游的TCF7L2均可導(dǎo)致胰島功能和形態(tài)學(xué)的異常，進(jìn)而導(dǎo)致糖耐量受損。Wnt3a、Wnt4均可通過激活經(jīng)典β-catenin依賴性Wnt通路促進(jìn)β細(xì)胞增殖，而Wnt4對(duì)β細(xì)胞分泌卻沒有明顯影響?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，我們合理假設(shè)MSC可以通過分泌Wnt蛋白、激活胰島β細(xì)胞及胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞中的β-catenin通路，改善胰島功能和微循環(huán)內(nèi)皮功能。
　　

7、研究目的
　　本研究旨在通過評(píng)估大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bmMSC)、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hucMSC)及臍帶血單核細(xì)胞(CBSC)單次或雙次輸注的治療效果，比較每種治療方案對(duì)糖尿病鼠血糖狀況、胰島功能、胰島素抵抗和慢性炎癥反應(yīng)的影響，以期探討各種干細(xì)胞的治療側(cè)重，為臨床應(yīng)用的干細(xì)胞選擇提供最優(yōu)方案，為干細(xì)胞個(gè)體治療方案的擬定提供依據(jù)。繼而我們通過bmMSC體外與胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞MS-1及離體胰島的共培養(yǎng)，探討了MSC分泌的Wnt

8、蛋白和胰島內(nèi)β-catenin依賴的Wnt通路對(duì)氧化應(yīng)激損傷下的MS-1和胰島功能的作用。
　　研究方法
　　第一部分不同種類干細(xì)胞靜脈輸注對(duì)2型糖尿病大鼠治療效果的比較
　　1、通過高脂高糖飲食+小劑量STZ誘導(dǎo)2型糖尿病SD大鼠模型，每周監(jiān)測(cè)血糖，確定造模成功。于造模成功后7天，對(duì)T2DM大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組:T2DM、T2DM+bmMSC、T2DM+hucMSC、T2DM+CBSC。對(duì)于T2DM+hucMSC的部分大

9、鼠，于首次輸注干細(xì)胞后2周進(jìn)行第二次干細(xì)胞治療，輸注HucMSC或CBSC。于第一次干細(xì)胞注射后2w、4w、8w分別進(jìn)行IPGTT并尾尖取血測(cè)血糖、胰島素、胰高糖素，三天后處死，留取空腹血及各類臟器。
　　2、比較不同處理組的血糖控制情況:每周檢測(cè)1次鼠尾血糖。IPGTT采用腹腔注射葡萄糖1.5g/kg體重，大鼠用異氟烷麻醉，剪尾取血。
　　3、比較不同處理組的胰島功能及形態(tài)學(xué)變化:放免法檢測(cè)空腹胰島素/胰高糖素及IPGTT

10、后的胰島素/胰高糖素曲線變化。胰腺石蠟切片HE染色觀察胰島形態(tài)及大小改變。胰腺石蠟免疫組化染色觀察胰島素陽性區(qū)域大小及比例改變。胰腺石蠟免疫熒光染色觀察胰島素(+)/胰高糖素(+)區(qū)域比例及PCNA、胰島素雙陽性細(xì)胞在胰島素陽性細(xì)胞中的比例。
　　4、比較不同處理組的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)改變:HOMA-IR、胰島素敏感性指數(shù)Matsuda index和胰島素敏感性指數(shù)Belfiore index評(píng)判大鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。同時(shí)肝臟Weste

11、rn blotting檢測(cè)p-AKT/t-AKT和p-Erk/t-Erk胰島素通路相關(guān)蛋白的表達(dá)趨勢(shì)。
　　5、比較不同處理組肝臟糖代謝的改變:提取肝臟蛋白，Western blotting檢測(cè)肝糖代謝關(guān)鍵酶糖原合成酶激酶(GSK3)、肝臟糖攝取關(guān)鍵蛋白葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子2(GLUT2)、糖酵解關(guān)鍵酶丙酮酸激酶(PK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)及糖異生關(guān)鍵酶葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶（G-6-Pase）、磷酸烯醇丙

12、酮羧基酶-1(PCK1)的表達(dá)量。同時(shí)肝臟組織石蠟切片糖原染色，觀察糖原儲(chǔ)存量的改變。
　　6、比較不同處理組的脂代謝的改變:生化法檢測(cè)TC、TG、LDL、HDL和FFA。
　　7、比較不同處理組的血清學(xué)代謝指標(biāo)及炎性因子的變化差異:ELISA法檢測(cè)IL-1b、IL-6、IL-17、IL-22、TNF-α及IFN-γ。
　　第二部分 MSC改善胰島及胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制研究
　　1、通過H202刺激構(gòu)建大

13、鼠離體胰島及胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞MS-1的氧化應(yīng)激損傷，并用Transwe11系統(tǒng)將其與bmMSC共培養(yǎng)，檢測(cè)離體胰島的活性及GSIS胰島素分泌，MS-1的活性、凋亡及eNOS活性等功能學(xué)指標(biāo)。
　　2、qPCR比較大鼠離體胰島及胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞MS-1與bmMSC的Wnt蛋白表達(dá)差異，并觀察bmMSC輸注后或Transwell培養(yǎng)后胰島及MS-1中β-catenin依賴性的Wnt通路的激活情況。
　　3、使用XAV-939

14、特異性阻斷胰島或MS-1中的β-catenin，觀察bmMSC共培養(yǎng)對(duì)H202誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的挽救作用是否被抵消。
　　4、對(duì)bmMSC中的Wnt4、Wnt5a分別進(jìn)行敲除，并將敲除后的bmMSC與胰島和MS-1分別共培養(yǎng)，觀察Wnt4和Wnt5a敲除對(duì)胰島和MS-1氧化應(yīng)激的活性變化、凋亡及胰島素分泌量、eNOS活性等功能學(xué)指標(biāo)的改變。
　　5、將分別敲除Wnt4、Wnt5a后的bmMSC與MS-1分別培養(yǎng)，觀察MS-

15、1中的β-catenin依賴性的Wnt通路的激活情況。
　　研究結(jié)果
　　第一部分不同種類干細(xì)胞靜脈輸注對(duì)2型糖尿病大鼠治療效果的比較
　　1、T2DM造模成功后SD大鼠血糖明顯升高，但干細(xì)胞輸注后空腹血糖較前明顯下降，該治療效果可維持至輸注后8w。不同干細(xì)胞及不同輸注次數(shù)的組間，空腹血糖水平無明顯差異。IPGTT結(jié)果顯示干細(xì)胞輸注后2w大鼠的餐后血糖并無明顯改善;然而至4w時(shí)各組各時(shí)點(diǎn)的血糖均較T2DM有明顯下降。8

16、w時(shí)，雖然空腹及餐后0.5h干細(xì)胞干預(yù)組仍可保持較好血糖控制，然而除了hucMSC+CBSC雙次注射組外，其余各組的1-3h血糖均與T2DM組無明顯差別。
　　2、干細(xì)胞輸注可顯著抑制T2DM大鼠升高的空腹胰高糖素，各組間效果無明顯差異。bmMSC或CBSC單獨(dú)輸注均可顯著改善T2DM大鼠的空腹胰島素水平，其他各組對(duì)此指標(biāo)的改善不明顯。胰島素釋放試驗(yàn)結(jié)果顯示，干細(xì)胞輸注2w時(shí)，bmMSC輸注組的餐后胰島素水平有明顯升高，其他組無明

17、顯改變，但各組釋放曲線形態(tài)均較紊亂;至4w時(shí)，各組胰島素釋放曲線明顯規(guī)整，基本均可于餐后3h回落至基線水平，其中bmMSC或CBSC單獨(dú)輸注的餐后胰島素水平均明顯高于T2DM未處理組;8w時(shí)，bmMSC輸注組的釋放曲線進(jìn)一步趨近正常，而hucMSC+CBSC雙次注射組表現(xiàn)出明顯的餐后胰島素釋放增多。除bmMSC組外，其他各組均可顯著抑制餐后胰高糖素的分泌。
　　3、干細(xì)胞輸注后2w及4w，干細(xì)胞可顯著保存胰島面積;在保存β細(xì)胞面積

18、方面，bmMSC的效果較明顯。對(duì)于改善胰島內(nèi)α、β細(xì)胞比例方面，干細(xì)胞輸注后2w各組均未見明顯改善;4w時(shí)，bmMSC表現(xiàn)出較為明顯的β細(xì)胞比例增加，而所有干細(xì)胞輸注組的α細(xì)胞面積均顯著減少，各組間無明顯差異;8w時(shí)，所有干細(xì)胞輸注組的α細(xì)胞面積均顯著減少的趨勢(shì)持續(xù)，而CBSC單次注射及hucMSC+CBSC、hucMSC*2次三組均表現(xiàn)為β細(xì)胞比例明顯增加:提示CBSC單次注射或干細(xì)胞2次注射可將改善β細(xì)胞比例的治療維持更久。

19、　　4、在干細(xì)胞輸注2w及4w時(shí)均可于CBSC單次輸注、hucMSC+CBSC及hucMSC*2次輸注組中觀察到PCNA陽性的β細(xì)胞明顯增多，提示β細(xì)胞增生。而觀察至8w，增生的情況明顯降低，唯有hucMSC+CBSC仍可觀察到明顯的增生。
　　5、本研究還觀察到CBSC組部分胰島細(xì)胞出現(xiàn)胰島素與胰高糖素共染的情況，但該現(xiàn)象并未在其他組中出現(xiàn)，提示CBSC可能促進(jìn)了α向β細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
　　6、經(jīng)過胰島素敏感性指數(shù)及肝臟胰島素

20、通路相關(guān)蛋白表達(dá)的雙重印證，bmMSC單次輸注、hucMSC單次輸注及hucMSC先后兩次輸注可顯著改善T2DM大鼠的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。
　　7、空腹的T2DM大鼠肝臟中存在糖原合成減少、糖酵解受抑、糖異生增加及胰島素抵抗;而干細(xì)胞的輸注可選擇性地作用于其中不同的關(guān)鍵酶，發(fā)揮調(diào)節(jié)作用:在改善肝糖原合成方面，本文涉及的所有干細(xì)胞輸注方案均有效果;改善葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)方面，bmMSC與hucMSC單次輸注效果明顯;bmMSC與hucMSC單次

21、輸注亦可促進(jìn)糖酵解、抑制糖異生并改善空腹肝臟胰島素抵抗。輸注多次干細(xì)胞的兩組對(duì)肝臟的作用則更多體現(xiàn)在抑制糖異生及改善胰島素抵抗方面。
　　8、除CBSC單次輸注組可觀察到明顯TC、TG下降外，其他各組對(duì)血脂指標(biāo)的改善不明顯。
　　9、hucMSC+CBSC及hucMSC*2次輸注可明顯改善各項(xiàng)炎癥相關(guān)免疫指標(biāo)，如IL-1b、IL-6、IL-17、IL-22及IFN-g。
　　第二部分 MSC改善胰島及胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞

22、功能的機(jī)制研究
　　1、bmMSC與MS-1細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著改善H202所致的凋亡、eNOS活性降低及VCAM升高;同時(shí)也可改善氧化應(yīng)激損傷后離體胰島的活性下降及高糖刺激下的胰島素分泌障礙。
　　2、bmMSC較離體胰島和MS-1細(xì)胞可表達(dá)顯著增高的Wnt4和Wnt5a。bmMSC靜脈輸注的T2DM大鼠胰島中存在β細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的β-catenin核轉(zhuǎn)位，同時(shí)與MSC共培養(yǎng)后的MS-1也存在β-catenin核轉(zhuǎn)位增加，提示

23、MSC可激活β細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中的經(jīng)典Wnt通路。
　　3、用XAV-939處理胰島及MS-1后，bmMSC的上述改善作用顯著降低，提示干細(xì)胞的有益作用可能由激活經(jīng)典Wnt通路介導(dǎo)。
　　4、在MSC中分別沉默Wnt4、Wnt5a后再與H202刺激的MS-1/離體胰島共培養(yǎng)，結(jié)果顯示W(wǎng)nt4沉默可顯著降低MSC對(duì)上兩者的改善作用:說明MSC分泌的Wnt4可能是介導(dǎo)其對(duì)氧化應(yīng)激胰島及內(nèi)皮細(xì)胞挽救作用的關(guān)鍵因子之一。
　　5

24、、在MSC中沉默Wnt4后MS-1細(xì)胞中經(jīng)典Wnt通路激活減弱，提示MSC分泌的Wnt4可通過激活經(jīng)典Wnt通路，改善胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的存活及功能。
　　研究結(jié)論
　　在我們的研究中，首次對(duì)比了骨髓、臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞及臍血干細(xì)胞，輸注一次或兩次對(duì)T2DM大鼠模型胰島功能和糖代謝的改善效果，首次觀察了干細(xì)胞輸注對(duì)胰島α細(xì)胞功能和比例的影響，并觀察了干細(xì)胞對(duì)IL-22的作用。
　　1、所有干細(xì)胞在降低T2DM空腹血

25、糖方面效力等同，但在平穩(wěn)餐后血糖方面唯有hucMSC+CBSC的治療組可將有效性持續(xù)至輸注后8w。
　　2、bmMSC和CBSC組改善空腹胰島素作用明顯，bmMSC和hucMSC+CBSC先后注射組改善糖負(fù)荷后胰島素分泌的作用可持續(xù)至8w。
　　3、CBSC單次注射或干細(xì)胞2次注射（T2DM+hucMSC&CBSC組及T2DM+hucMSC*2組）可將改善β細(xì)胞比例的治療維持更久，可能與維持持續(xù)性的β細(xì)胞增生有關(guān)。
　

26、　4、各種干細(xì)胞輸注均可明顯抑制胰高糖素空腹及餐后的分泌，并抑制α細(xì)胞的增生。
　　5、bmMSC單次輸注、hucMSC單次輸注及hucMSC先后兩次輸注均可顯著改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。
　　6、本文涉及的所有干細(xì)胞輸注方案均可改善肝糖原合成;bmMSC與hucMSC單次輸注可顯著改善肝臟葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，亦可促進(jìn)糖酵解、抑制糖異生;hucMSC雙次輸注可促進(jìn)糖酵解、抑制糖異生。
　　7、CBSC單次輸注可明顯降低TC、TG。<