脂肪間充質(zhì)干細胞治療大鼠Ⅰ型糖尿病的效果及機理探討.pdf

1、背景和目的:糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是一種復(fù)雜的代謝性疾病，目前的治療方法主要有藥物治療、胰島素注射、胰島和胰腺移植，但由于外源胰島素注射并不能成功模擬正常胰島β細胞的胰島素分泌，胰島移植缺乏器官捐獻者，可見這些治療方法存在較大的局限性。目前具有高度自我更新和多向分化潛能的干細胞成為了研究治療糖尿病的新希望。本研究探討了脂肪間充質(zhì)干細胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)治療大鼠

2、Ⅰ型糖尿病的效果，并研究其定向誘導(dǎo)成胰島樣β細胞后相關(guān)信號通路mRNA和蛋白改變情況，及治療Ⅰ型糖尿病前后效果的機理探討，為今后利用成體干細胞治療糖尿病提供實驗和理論依據(jù)。
　　研究方法:體外分離培養(yǎng)大鼠ADSCs，對其進行形態(tài)觀察、表面標(biāo)志鑒定以及定向誘導(dǎo)成胰島樣β細胞，并對誘導(dǎo)后細胞進行形態(tài)觀察、雙硫腙染色、免疫組織化學(xué)法、PCR、q-PCR和Western Blotting檢測insulin及胰島樣細胞相關(guān)基因的表達鑒定，同

3、時與大鼠自身胰腺成體干細胞(Pancreas adult stem cells，PASCs)相比較。接著檢測ADSCs成胰島樣β細胞誘導(dǎo)過程中涉及的分子信號，檢驗隨時間依賴的Wnt信號通路中關(guān)鍵因子Dvl2、Gsk3β、β-catenin等和Insulin在mRNA和蛋白水平的變化。鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ)誘導(dǎo)大鼠糖尿病模型，并對其分別進行DiI標(biāo)記的ADSCs、ADSCs成胰島樣β細胞誘導(dǎo)后細胞、PASCs移植。

4、與臨床檢測系統(tǒng)相結(jié)合分析，觀察細胞移植前后大鼠血糖、體重、葡萄糖耐量、尿糖、尿液量和飲水量的變化，石蠟組織切片HE染色檢測胰島形態(tài)變化，冰凍組織切片熒光檢測DiI標(biāo)記細胞的分布，Western Blotting檢測糖尿病大鼠細胞治療前后Wnt信號通路分子表達的改變?？偨Y(jié)ADSCs治療大鼠Ⅰ型糖尿病的效果。
　　結(jié)果:1.分離到較純的ADSCs，ADSCs成胰島樣β細胞誘導(dǎo)后可形成胰島樣圓形細胞團，雙硫腙染色呈棕紅色，PDX1、CK

5、19、Nestin、Insulin免疫組化染色均呈陽性;經(jīng)RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，成胰島樣β細胞誘導(dǎo)后的ADSCs中表達insulin、PDX1和glucagon;經(jīng)q-PCR檢測得出，成胰島樣β細胞誘導(dǎo)后的ADSCs中insulin, Gcg，Gck, GLUT2，Irs1，Irs2表達量分別為PASCs的0.69倍(P＜0.05)，2.12倍(P＜0.01)，1.15倍(P＞0.05)，0.58倍(P＜0.01)，1.38倍(P＜0.

6、01)，0.83倍(P＜0.01);同時，成胰島樣β細胞誘導(dǎo)后的ADSCs可表達Insulin蛋白。2.在ADSCs成胰島樣β細胞誘導(dǎo)過程中，insulin mRNA和蛋白質(zhì)表達量升高(P＜0.01);同時Gcg和Gck mRNA表達量升高(P＜0.05)，而Irs mRNA表達量先下降后升高(P＜0.01)，Irs2 mRNA表達量先上升后下降(P＜0.01)。在此過程中，Dvl2、Lrp5、GSK3β mRNA表達量上升(P＜0.0

7、5);β-catenin mRNA表達量上升，但變化不顯著(P＞0.05); Tcf7l2 mRNA表達量在6-10d上升(P＞0.05)。相應(yīng)地，Dvl2、GSK3β、p-GSK3β蛋白表達量升高(P＜0.01)，non-p-β-catenin蛋白表達量變化不顯著(P＞0.05)，與mRNA相對表達量變化趨勢一致。3.成功構(gòu)建大鼠Ⅰ型糖尿病模型，PASCs、ADSCs和ADSCs成胰島樣β細胞誘導(dǎo)后的細胞移植組對Ⅰ型糖尿病大鼠均有一定

8、的治療效果，使其在10w內(nèi)較糖尿病大鼠和注PBS溶液對照組大鼠血糖降低，體重增加，葡萄糖耐受性改善，尿糖、尿液量和飲水量均有所降低，并且ADSCs成胰島樣β細胞誘導(dǎo)后的細胞移植組較其他組治療效果明顯。4.石蠟組織切片HE染色和冰凍組織切片熒光檢測表明，PASCs、ADSCs和ADSCs成胰島樣β細胞誘導(dǎo)后的細胞移植組對Ⅰ型糖尿病大鼠胰島有一定的修復(fù)作用，使其胰島內(nèi)的β細胞增多。3組細胞已成功移行至胰腺組織，并且DiI標(biāo)記的紅色熒光細胞也

9、有部分移行至脾、腎組織。5.Western Blotting檢測糖尿病大鼠較正常大鼠Dvl-2、non-p-β-Catenin、GSK3β、p-GSK3β、Insulin蛋白的相對表達量明顯下降(P＜0.01);而細胞移植組大鼠這5種蛋白的相對表達量較糖尿病大鼠上升(P＜0.05)。
　　結(jié)論:上述結(jié)果表明誘導(dǎo)ADSCs分化為胰島樣β細胞的過程中，可激活Wnt信號通路，但非磷酸化β-catenin蛋白的富集作用不明顯。移植PASC